チタン - 株式会社チェリーブロッサム

Scientific Reports volume 13、記事番号: 470 (2023) この記事を引用

809 アクセス

1 オルトメトリック

メトリクスの詳細

優れた機械的特性と高い生体適合性を備えた新しい生体材料の開発は、過去数十年間の重要な課題でした。ナノ結晶金属は、高強度生体材料を製造する新たな機会を提供していますが、これらのナノ金属の生体適合性は改善する必要があります。本研究では、生体適合性に優れた高強度生体材料として、金属タンパク質ナノ複合材料を紹介します。哺乳類の体内に豊富に存在するタンパク質であるウシ血清アルブミンを少量 (2 および 5 vol%) チタンに添加し、高圧ねじりによる厳しい塑性変形プロセスを使用して 2 つのナノ複合材料を合成します。これらの新しい生体材料は、ナノ結晶純チタンと同様の高い硬度を示すだけでなく、ナノチタンと比較して優れた生体適合性（細胞の代謝活性、細胞周期パラメーター、DNA断片化プロファイルなど）も示します。これらの結果は、人体からの化合物を利用して新しい生体適合性複合材料を設計する道筋をもたらします。

近年、生体材料はさまざまな用途で大きな注目を集めています。インプラントは荷重下で人体の組織、骨、体液と直接接触するため、インプラント用の金属生体材料の開発は、研究と技術の両方の観点から特に重要な問題です。人体は非常に腐食性が高く複雑な環境であり、耐荷重人工材料を人体に埋め込むとさまざまな種類の腐食が発生します1、2、3。体液には、さまざまな有機化合物と注目すべきさまざまなタンパク質が含まれています。人間の体内には約 105 種類の異なるタンパク質があり、それぞれが特定の役割を持っています。これらのタンパク質の中で、アルブミンは血漿および滑液中に最も豊富に存在するタンパク質であると報告されており 4、したがって、人工材料を移植できるあらゆるヒト組織に存在します。

生体適合性に大きな影響を与える初期段階の 1 つは、体液から生体材料表面へのタンパク質の瞬間的な吸着です。さらに、タンパク質の吸着は、生体材料表面への細胞の接着を可能にする最初の最も重要な段階であると考えられており、したがって、整形外科用インプラントのオッセオインテグレーションなどの関連する臨床現象がこの段階で進行します1、2、3、4。アルブミンはヒトの血液タンパク質の中で最も強力な金属結合剤であることが確認されているため、インプラント表面へのアルブミンの吸着は、生体適合性、腐食、トライボロジーなどの表面機能を決定する上で重要な役割を果たします5。タンパク質は材料の表面に厚い層を形成し、細胞はこの層を通して異物の表面を感知して反応を開始します。インプラントに関するいくつかの報告では、表面にタンパク質を含む層が存在することが明確に明らかにされており 1,6 、細胞レベルでのタンパク質と生物医学用合金との相互作用の重要性が示されています。

チタンとその合金は、ステンレス鋼や Co-Cr 合金などの他の生体材料と比較して、低い弾性率、高い疲労強度、優れた耐食性、優れた生体適合性により、さまざまなインプラントの潜在的な生体材料として広く使用されています7、8。密度は 4.5 g/cm3 で、ステンレス鋼や Co-Cr 合金の約半分です9。しかし、チタンとその合金の主な欠点は、ステンレス鋼や Co-Cr 合金と比較して強度と硬度が低いことです7、8、9。最近の研究では、チタンのナノ構造化が生体適合性を損なうことなく強度と硬度を向上させる効果的な解決策であることが示されました 10,11。

チタンインプラントの使用が成功するかどうかは、弾性率や硬度などの機械的特性だけでなく、骨とインプラントの界面でのオッセオインテグレーションにも依存します12。しかし、Ti ベースの材料は非生物活性であるため、骨と直接結合することができず、移植の初期段階でその表面での新しい骨の形成を促進します 13,14。 Ti ベースの材料のオッセオインテグレーションを改善するために、表面修飾に基づいた 2 つの主な方法が採用されています。(1) 物理的および/または化学的変化による表面トポグラフィーの制御 15,16。 (2) インプラント表面への生物活性分子の固定化17、18。 2 番目のアプローチでは、コラーゲン 19 やウシ血清アルブミン (BSA)5、20、21、22 などのタンパク質を豊富に含むコーティングを使用することで、Ti ベース合金の生体適合性を高めることができます。

いくつかの研究 20、21、22、23、24 では、Ti ベースの合金をタンパク質でコーティングしたり、リン酸緩衝食塩水 (PBS) で希釈した高濃度の BSA を含む溶液にさらしたりすると、生体適合性に対する有益な効果が実証されました。参考文献20、21、22では、BSAでコーティングすると水素発生と陽極溶解反応が抑制され、保護膜の抵抗が増加し、純チタンやTi-6AlなどのTiベース合金への細胞接着が改善されることが示されています。 -4V、Ti-6Al-7Nb、Ti-6Al-4V-1Zr (重量%)。同様の方向で、BSA が Ti-6Al-4V 合金の高濃度で合金不動態皮膜の安定性を高めることも示されました 23。 BSA タンパク質 24 を含む溶液に曝露した Ti-3Cu (重量%) 合金の場合、溶液中の BSA 含有量が増加すると耐食性は向上し、抗菌能力は低下しました。しかし、Ti ベースの合金の表面に BSA などのタンパク質種が吸着すると、イオン放出が促進され、細胞の接着が妨げられる可能性があることを明らかにした研究はほとんどありません 25、26。

インプラントの生体適合性を高める上でのタンパク質コーティングの重要性にもかかわらず、これらのタンパク質を豊富に含むコーティングは金属基材との結合が弱い。このような弱い結合により、時間の経過とともに層間剥離が発生する可能性があり、長期の移植ではこのコーティング技術が失敗する可能性があります 27,28。タンパク質のような第 2 相を金属材料に永久的に組み込むことは、タンパク質でコーティングされたインプラントの層間剥離の問題を回避する潜在的な解決策となり得ますが、そのような金属 - タンパク質複合材料を製造する試みはこれまでありませんでした。

この研究では、長期移植に適した高強度と良好な生体適合性を備えた生体材料を製造するために、タンパク質粒子が第二相として純粋なナノ構造チタンに直接挿入されます。バルクナノ複合材料は、高圧ねじり (HPT) という厳しい塑性変形法によって製造されます。純チタンに比べ硬度が高く、生体適合性に優れ、タンパク質コーティングで問題となる層間剥離の心配もありません。金属タンパク質複合生体材料のこの最初の導入により、幅広い生物医学用途への新たな道が開かれます。

生体材料の調製には、純度 99.9%、粒径 45 μm 未満のチタン粉末と BSA 粉末を使用しました。 BSA は Amresco (米国オハイオ州ソロン) から純度 98% で入手し、さらに精製せずに使用しました。チタン粉末をBSA粒子と0、2および5体積%の割合で機械的に混合した。次に、図1a〜cに示すように、得られた粉末混合物を手動油圧プレスを使用して、300 MPaの印加圧力下で直径10 mm、厚さ約1 mmのディスク形状に予備圧縮しました。次に、HPT 法を圧縮ディスクに適用して、良好な混合レベルでバルクナノ複合材料を調製しました。 HPT 法は、図 1d 29 に示すように、ディスク状のサンプルを 2 つのアンビル間で高圧下で圧縮し、一方のアンビルを他方のアンビルに対して回転させることによってせん断歪みを誘発する、厳しい塑性変形技術です。ＨＰＴプロセスは、２ＧＰａ、室温で、毎分１回転の回転速度で５回転行った。 HPT 法が複合材料の合成に選択された理由は、次の 3 つです。 (1) この方法は、高密度の格子欠陥を備えたナノ構造材料を製造できるプロセスとして十分に確立されています30、31、32、33、34。 (2) この方法は、周囲温度で粉末混合物からバルク複合材料を製造するために使用できます 33,34。 (3) HPT によって処理されたナノ構造 Ti ベース材料は、良好な生体適合性と高強度の両方を示すことができます 32,33,34,35。

(a、b) BSE モードの SEM 画像、および (c) HPT 処理前の Ti + 5 vol% BSA の対応する EDS 元素マッピング。 (d) HPT 法とそのアンビルの概略図 29。 ( d 、 f 、 g ) 2 GPa で HPT を 5 回回転させた後の、Ti + 5 vol% BSA 複合材料の BSE モードでのさまざまな倍率の SEM 画像。

HPT 処理後、微細構造、機械的および生体適合性の調査のために、サンプルは鏡のような表面に研磨されました。 HPT 処理サンプルの機械的特性と生体適合性の結果を、1073 K で 1 時間アニールした平均粒径 200 μm の基準粗粒バルク純チタン (99.9%) と比較しました。

走査電子顕微鏡 (SEM) 技術を使用して、マイクロメートルレベルで微細構造の特徴を調査しました。 SEM 画像は、JEOL JSM-7900F 顕微鏡では 15 kV、Bruker Nano X-Flash を搭載した FEG Philips XL-30 顕微鏡では 25 kV の加速電圧下で、二次電子および後方散乱電子 (SE および BSE) 信号を使用して撮影されました。 6|60 エネルギー分散型 X 線分光法 (EDS) 検出器。 SEM 画像は、HPT 処理されたディスクの中心から 4 mm 離れた位置で撮影されました。

透過電子顕微鏡および走査透過電子顕微鏡 (TEM および STEM) は、収差補正顕微鏡 (JEOL JEM-ARM200F) を使用し、加速電圧 200 kV で実施しました。 TEM および STEM では、HPT 加工したディスクの中心から 2 ～ 5 mm の位置で、放電加工機を使用して直径 3 mm のディスクを切り出しました。 3 mm ディスクは、最初に研磨紙で 100 μm の厚さに研削され、その後、5% HClO4、25% C3H3(CH2)2CH2OH および 70% の溶液を使用する従来のツインジェット電気化学研磨機によって電子透過性を高めるためにより薄い厚さに研磨されました。 % CH3OH、12 V の電圧、263 K の温度下。TEM および STEM による微細構造検査は、明視野および暗視野 (BF および DF) 画像、高角度環状暗視野 (HAADF) 画像によって行われました。選択視野電子回折 (SAED) および EDS マッピング。

結晶構造分析のために、Cu Kα 放射線 (波長 λ = 0.15406 nm) を使用して 45 kV および 40 mA で動作するグラファイトモノクロメーターを備えた X'Pert Panalytical 回折計を使用して、サンプルを X 線回折 (XRD) 法によって検査しました。

機械的特性分析では、HPT 処理ディスクの中心から端までの 4 つの異なる半径方向でサンプルの上面に 500 gf の荷重と 15 秒の滞留時間を使用してビッカース微小硬度を測定しました。

生体適合性は 2 つの主要なテストによって評価されました。(1) 改良された 3-(4,5-ジメチルチアゾール-2-イル)-2,5-ジフェニルテトラゾリウムブロミド (MTT) アッセイ。 (2) フローサイトメトリーによる細胞周期と DNA 断片化プロファイルの分析。このシーケンスでは、生体適合性試験の詳細が示されます。

マウス前骨芽細胞株 (MC3T3-E1) は、10% ウシ胎児血清 (FBS)、2 mM L-グルタミン、100 U/mL ペニシリン、および 100 μg/mL ストレプトマイシンを添加したアルファ最小必須培地 (α-MEM) で維持されました。 MC3T3-E1 セルは、サンパウロ大学 (USP) の生物医学研究所から提供されました。、ブラジル。

コンフルエンス 80% の MC3T3-E1 細胞をトリプシン処理し、α-MEM で不活化し、Countess II 自動カウンター (Thermo Fisher Scientific Inc.、米国マサチューセッツ州ウォルザン) で計数しました。 HPT処理したディスクを24ウェルプレートに配置しました(ウェルあたり1枚のディスク)。ディスクをバイオセーフティキャビネット内で一晩紫外線にさらして滅菌し、60 μL の細胞懸濁液 (1 × 105 細胞) をディスクの表面にプレーティングしました。プレートを 5% CO2 を含む加湿雰囲気中で 310 K で 2 時間インキュベートしました。次に、1 mL の α-MEM を各ウェルに添加し、プレートを 5% CO2 を含む加湿雰囲気中で 310 K でインキュベートしました。

MTT アッセイは、細胞の生存率、増殖、細胞毒性の指標として細胞の代謝活性を測定するために使用されます。 MTT アッセイは、代謝活性のある細胞による黄色のテトラゾリウム塩、3-(4,5-ジメチルチアゾール-2-イル)-2,5-ジフェニルテトラゾリウムブロミド (MTT) の紫色のホルマザン結晶への還元に基づいています。 48 時間の播種後、培地を吸引し、MTT (PBS 中 0.5 mg/mL) を細胞に添加し、5% CO2 を含む加湿雰囲気中、310 K で 3 時間インキュベートしました。増殖培地を排出し、２５０μＬのジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を各ウェルに添加して、ＭＴＴを溶解した。吸光度は、走査分光光度マルチウェルプレートリーダー（F5 Microplate Reader、Molecular Probes）を使用して570 nmで測定しました。

フローサイトメトリーアッセイでは、HPT 処理したディスクを 24 ウェルプレート (ウェルあたり 1 枚のディスク) に配置し、紫外線で 12 時間滅菌し、リン酸緩衝生理食塩水ですすぎました。約 1.8 × 105 個の細胞を各ディスクにプレーティングしました。 48時間の播種後、細胞を回収し、PBSで洗浄した。冷エタノール (70%) を使用して細胞を 30 分間固定し、1 mg/mL RNase を含む PBS で希釈した 50 μg/mL ヨウ化プロピジウム (PI) を使用して 30 分間染色しました。細胞を暗所で室温に維持した。周期の異なる段階にある細胞のパーセンテージは、Accuri™ C6 ソフトウェア (BD Biosciences) を使用して、PI 染色された核に基づくフローサイトメトリー分析によって評価されました。

図1a〜cは、5 vol%のBSAを含む複合材料のHPT処理前のコンパクトディスクの選択された元素のEDS元素マッピングを含むSEM画像を示しています。この場合、このサンプルの表面には研磨処理が施されていません。 BSE画像（図1a、b）の組成コントラストからわかるように、チタン粒子とBSA粒子の間にはマイクロメートルレベルで適度な混合が存在します。灰色の粒子は寸法が 10 ～ 45 μm の範囲のチタンを指し、黒色の粒子は BSA タンパク質を指します。 BSA は、C、H、O、N、S 原子を含む線状ポリマーです4。図1cに示す元素マッピングは、黒色粒子がチタンマトリックスに囲まれた炭素原子を含むBSAタンパク質に対応することを確認しています。

図 1e ～ g は、HPT 処理後の 5 vol% の BSA を含む複合材料の BSE 画像を示しています。組成コントラストと EDS 分析で示されているように、黒い領域は BSA タンパク質に関連しています。これらの画像は、HPT 処理によって激しい塑性変形が行われた後、BSA タンパク質がチタン粒子と混合され、サンプル全体に分布する明確に定義されたタンパク質層を形成する一方、チタン相は三次元ネットワークを維持していることを示しています。チタンとBSAの層状構造を形成するHPTの能力は、チタンとBSAの弾道微細構造の進化に対するせん断ひずみ効果の結果であり、一方、高い静水圧は、異なる構造と特性を持つ2つのコンポーネントの共変形を促進します。 HPT 法のこの機能は、金属 - 金属複合材料 36、金属 - セラミック複合材料 37、金属 - 炭素複合材料 38 などのさまざまな Ti ベースの複合材料の製造にすでに採用されています。ここで、図1e〜gに示す微細構造は、Ti-BSA複合材料を断面図からSEMで検査したときにも観察されたことに注意する必要があります。これは、HPT処理された金属で通常観察される特徴です30。

図2a、bに示すように、STEM-HAADFとEDSを使用した高倍率での微細構造の検査により、チタンとBSAがナノメートルスケールで良好に結合していることが確認されました。この結合の性質を解明するには将来の理論計算が必要ですが、その特徴は人体内のチタンインプラント上のタンパク質の吸収で観察されるものと類似しているはずです。チタンとタンパク質の結合は一般に 2 つのステップに従います: (1) 水素結合、および (2) プロトン移動 39。いくつかの研究では、このような結合は OH 基とチタンの相互作用によって強化されることが示唆されています 40,41。一方、分子動力学シミュレーションでは、結合におけるアミド基とカルボキシル基の静電相互作用の重要性が報告されています 42,43。

2 GPa で HPT を 5 回回転させた後の Ti + 5 vol % BSA 複合材料の STEM および TEM 分析。 (a) HAADF 画像および (b) Ti を使用した対応する EDS マッピング。 (c、f) TEM-BF 画像。 (d,g) (c,f) に対応する SAED パターン。 (c) TEM-DF 画像。

サブマイクロメートルおよびナノメートルレベルで複合材料の微細構造の特徴をさらに調査するために、TEM 分析が採用されました。図 2 は、HPT 処理後の 5 vol% BSA を含む複合材料の代表的な TEM 画像を示しています。 BFおよびDF画像（図2c、e）は、平均粒径90nmのナノメートルまたはサブマイクロメートルサイズのいくつかのチタン超微粒子の存在を示しています。図2cに示す領域から取得したSAEDパターン（図2d）は、明確に定義されたリングを示しており、選択した領域にランダムな配向を備えた超微粒子が存在することを示唆しています。図２ｄの見かけのリングは、六方最密充填（ＨＣＰ）構造を有するチタンに属している。 BSAタンパク質を含む複合材料の領域から取得したBF画像（図2f）とそれぞれのSAEDパターン（図2g）は、図に示すハローリングパターンによってよく特徴付けられるBSAの非晶質の性質を示しています。 SAEDパターン。

図 3 は、HPT で処理した後の純チタンと 2 および 5 vol% の BSA を含むサンプルの XRD パターンを示しています。よくわかるように、すべてのサンプルの XRD パターンは、TEM 分析とよく一致して、チタン六方晶構造 (P63/mmc) を表す単一相の存在を示しています。 HPT 処理後の XRD パターンには新しい相は現れません。 XRD パターン間の唯一の違いは、BSA 比率の増加に伴う XRD ピークの強度の減少に関連しています。

2 GPa で HPT を 5 回回転させた後の、純チタンと 2 および 5 vol% の BSA を含む複合材料の XRD パターン。

HPT 処理による BSA タンパク質の添加後のサンプルの機械的特性を把握するために、せん断歪みが最大となるディスクの中心から 4 mm 離れた位置で得られたビッカース微小硬度を比較しました。図 4 は、HPT 処理後のサンプルの微小硬度の平均値を示しています。微小硬度について得られた値は、3 つの HPT 処理サンプル間で非常に類似しており、5 vol% までの BSA の少量添加が硬度に悪影響を与えないことを示しています。測定値は 344 ～ 353 HV の範囲にあり、HPT34、44 で処理された Ti 基合金に関する文献に記載されている値とよく一致しています。図 4 は、Ti-BSA 複合材料の硬度が、基準の粗粒焼鈍チタンの硬度よりも 2 倍以上高いことを示しています。

純チタン、および 2 GPa で 5 回転の HPT によって製造された 2 および 5 vol% の BSA を含むナノコンポジットのビッカース微小硬度と、粗粒焼鈍チタンの硬度との比較。

ここで、機械的性質に関して2つの点に注意してください。まず、サポート情報の図S1に示すように、硬度はディスクの中心で最も低く、ディスクの中心からの距離が増加するにつれて増加しました。ディスク中心からの距離の増加に伴うせん断ひずみの増加によるこれらの不均一性は、ディスク中心からエッジまでの硬度値が定常状態に飽和するように回転数を増やすことで回避できます29,30。第二に、HPT による純チタン粉末の圧密により 1 GPa の引張降伏強度と 12% の延性が得られましたが 45、タンパク質相の存在により引張下での延性がなくなり、これは金属セラミック複合材料で通常観察される事実です。複合材料は圧縮荷重下で優れた機械的性能を発揮しますが、生物医学用途を含むあらゆる用途に複合材料を使用する場合は、引張下での限られた延性を常に考慮する必要があります46。

HPT処理後のナノ複合材料の細胞生存率は、MC3T3-E1細胞を用いたインビトロ細胞培養実験によって評価されました。 MTT アッセイによる生体適合性評価の結果を図 5 に示します。図 5 の吸光度が高いほど、細胞の代謝活性が高いことを示していることに注意してください。まず、図 5 から明らかなように、HPT で処理されたすべてのサンプルは、粗粒チタン基準と比較して優れた生体適合性を示します。同様の方向で、参考文献 32、34、35 も、HPT 処理後の Ti ベース合金の生体適合性の改善を示しています。さらに、図 5 の HPT で処理したサンプルのうち、BSA を含むサンプルは、BSA を含まないサンプルと比較して、優れた生体適合性を示しました。 HPT 処理サンプルの生体適合性の向上は BSA 含有量に比例するようで、5 vol% の BSA を含むサンプルが最良の生体適合性挙動を示します。インプラントの表面に吸着されたタンパク質は、その分化や増殖を含む細胞表面相互作用を媒介するため、通常、Ti-BSA ナノ複合材料では、特に初期段階で、より良好なオッセオインテグレーションプロセス、その結果として優れた組織統合が達成されることが期待されます。インプラントの。

純チタンと、2 GPa で 5 回転の HPT によって生成された 2 および 5 Vol% の BSA を含むナノ複合材料について、570 nm の吸光度で調べた MTT 細胞生存率アッセイを、粗粒アニールチタンの硬度と比較しました。データは、4重に実行され、クラスカル・ウォリス分散分析およびマン・ホイットニー検定による一対比較によって比較された実験の平均±標準偏差として示されています。

図 6 は、チタン参照サンプルを含む HPT によって処理されたサンプルの MC3T3-E1 細胞の細胞周期プロファイルを示しています。細胞をヨウ化プロピジウム（PI）で染色し、発せられる蛍光をパルスシグナルとしてシグナル面積（FL2-A）を求めた。細胞周期分析では、FL2-A のヒストグラムプロットで 10,000 のイベントが収集されました。図6aでは、PIデータはy軸に細胞数、x軸にPI蛍光強度をとったヒストグラム上にあります。ヒストグラムは、G0/G1、G0/G1 の 3 つの異なるフェーズの細胞数を示します。 S および G2/M を 48 時間。図6bで観察できるように、G0 / G1、S、およびG2 / M期に存在する細胞の数は、すべてのサンプル間で非常に類似しており、BSAの添加によって増加または減少などの歪みや異常が促進されなかったことを示しています。周期プロファイルのさまざまな段階にある細胞の数。言い換えれば、各段階の細胞の数は、組成や処理経路に関係なく、サイクルプロファイル中に変更されずに維持されます。

MC3T3-E1 細胞の細胞周期プロファイル。 (a) G0/G1 (青)、S (赤)、および G2/M (緑) 期の細胞周期の各期における細胞の分布を示すサンプルの代表的なヒストグラム。 (b) 各フェーズの細胞数の分布または割合の定量分析。サンプルあたり少なくとも 10,000 のイベントから実行されます。データは、4重に実行され、クラスカル・ウォリス分散分析およびマン・ホイットニー検定による一対比較によって比較された実験の平均±標準偏差として示されています。

図 7 は、チタン参照を含む HPT によって処理されたサンプルの MC3T3-E1 細胞の DNA 断片化を示しています。図 7a では、細胞 DNA 断片化のヒストグラムは、サンプルの DNA 断片化が 1.5 ～ 2.0% の範囲の値を示していることを示しています。これは、BSA の添加や HPT 処理でさえ、サンプルに予期せぬ動作を引き起こさないことを示しています。特に、図 7b に示されている値は、重大な変化をサポートする非常に狭い範囲内にあるためです。したがって、細胞周期分析から得られた結論と同様に、BSA をチタンに添加しても、HPT による処理後の DNA 断片化が増加するため、MC3T3-E1 細胞のアポトーシスは誘導されません。

MC3T3-E1 細胞の DNA 断片化。 (a) 細胞断片化の割合の代表的なヒストグラム。 (b) 断片化された DNA を持つ細胞の数がパーセンテージで表示されます。データは、4重に実行され、クラスカル・ウォリス分散分析およびマン・ホイットニー検定による一対比較によって比較された実験の平均±標準偏差として示されています。

今回の研究では、長期移植のために、高強度で良好な生体適合性を備えた金属タンパク質ナノ複合材料が導入された。ナノ複合材料は、チタンなどの生体適合性金属と、2 および 5 vol% の BSA などの少量の内因性タンパク質との混合物です。 HPT 法がこれらの新しい複合材料の合成に選択されたのは、この方法により 2 相間のナノメートルレベルで良好なレベルの混合が確保され、生物医学用途に望ましい高硬度のナノ構造が得られるためです。

SEM、STEM、TEM、および XRD 分析によって行われた金属タンパク質ナノ複合体の初期特性評価により、これらの新しい生体材料の興味深い微細構造的側面が明らかになりました。この複合材料は、平均粒径 90 nm のチタンの超微粒子を含むナノ結晶構造の存在とともに、チタンと BSA タンパク質が良好なレベルで混合していることを示しました。強化された硬度を示す超微粒子およびナノ結晶材料の製造は、生体材料用途における HPT の最も魅力的な側面の 1 つです 29、30、31、32、33、34、35。 HPT プロセス後の金属タンパク質ナノ複合材料では新しい相は確認されませんでした。これは、高い硬度はナノ構造によるものであり、ω-Ti 相の形成によるものではないことを示しています 45。これらの微細構造の特徴により、金属-タンパク質ナノ複合材料は、基準の粗粒チタンの硬度よりも 2 倍高い硬度レベルを示しました。さらに、BSA の添加 (BSA の最大 5 vol%) は硬度に悪影響を及ぼさず、少量のタンパク質添加が高強度生体材料を開発するための実用的な解決策であることが確認されました。

HPT処理後の金属-タンパク質ナノ複合体の生体適合性は、MC3T3-E1細胞を使用した直接細胞培養実験によってテストされました。結果は、2 および 5 vol% の BSA を含む金属-タンパク質ナノ複合材料が、純粋なナノ結晶および粗粒チタン基準と比較して優れた生体適合性を示すことを示しました。さらに、5 vol% の BSA を含む複合材料は、すべてのサンプルの中で最高の生体適合性挙動を示しました。細胞と金属タンパク質ナノ複合体との相互作用に関連する他の重要な側面も、細胞周期プロファイルと DNA 断片化の結果で示されました。これらのテストは、チタンへの BSA の添加が、周期プロファイルのさまざまな段階での細胞数の増加または減少などの歪みや異常を誘発せず、また、MC3T3-E1 細胞のアポトーシスも誘発しないという明確な証拠を示しました。 HPT による処理後の DNA 断片化が増加します。金属タンパク質ナノ複合体の優れた生体適合性は、優れた細胞増殖と接着を示す MC3T3-E1 細胞と相互作用する表面を含む材料全体に BSA タンパク質が存在することに起因すると考えられます。 HPT 中の温度上昇が熱変性を引き起こすことはあまり重要ではありませんが 47,48、以前の出版物で示唆されているように、BSA の低温変性とタンパク質のアンフォールディングプロセスは 2 GPa の高圧下で発生する可能性があることに注意する必要があります 49,50。高圧下ではこれらの三次元構造変化の可能性があるにもかかわらず、BSA は現在の Ti-BSA 複合材料の生体適合性を高める効果を維持しています。

Ti ベースの合金中の BSA の存在によるこのプラスの生体適合性効果は、報告されているインプラント上のタンパク質コーティングの効果とよく一致しています 20、21、22、23、24。タンパク質でコーティングされたインプラントは長期間剥離に悩まされますが、この研究では HPT プロセスによる冷間圧密によって BSA タンパク質がチタンの第 2 相として導入されました。したがって、この新しい金属タンパク質ナノ複合材料ファミリーは、層間剥離の問題が起こりにくいと予想されますが、この問題を確認するには長期にわたる試験が必要です。 HPT による冷間圧密はほぼあらゆる種類の複合材料に適用できるため、この研究は幅広い金属タンパク質ナノ複合生体材料の設計と合成への道を開きます。

本研究では、高硬度で生体適合性に優れた新しい生体材料として、金属タンパク質ナノ複合材料を紹介します。ナノ複合材料は、純粋な金属チタンと哺乳類の内因性タンパク質であるウシ血清アルブミン (BSA) を高圧ねじりによって混合することによって合成されました。この研究から次の結論が得られました。

電子顕微鏡検査では、チタンと BSA タンパク質が良好なレベルで混合していることが示され、チタンの粒径は十分にナノメートルレベルでした。

金属-タンパク質ナノ複合体の微小硬度は、ナノ結晶純チタンと同様であり、粗粒純チタンよりも2倍以上高かった。

X 線回折は、BSA の添加とそれに続く処理が材料への新しい相の形成を促進しないことを示しました。

MC3T3-E1 細胞を使用した in vitro 細胞培養実験によって評価されたサンプルの細胞生存率は、BSA 生体分子の存在によって促進される細胞増殖の促進により、5 vol% の BSA を添加すると最高の生体適合性が得られることを示しました。

BSA の添加は細胞プロファイルの変化や DNA 断片化を促進しなかったことから、ここで研究した生体材料は、高硬度および高生体適合性を備えたインプラントとして使用できる優れた選択肢であることが示されました。

現在の研究中に生成されたデータセット、および/または現在の研究中に分析されたデータセットは、合理的な要求に応じて責任著者から入手できます。

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この研究の一部は、日本の文部科学省の新学術領域研究助成金 (JP19H05176、JP21H00150 & JP22K18737) およびブラジルのサンパウロ研究財団 (FAPESP) (2019/06951-3) の支援を受けています。 MC3T3-E1 細胞を提供していただいたサンパウロ大学生物医科学研究所 (USP) の Cecilia Helena de Azevedo Gouveia 教授に感謝いたします。

カンピナス大学応用科学部 (FCA-UNICAMP)、ペドロザッカリア、リメイラ、130013484-350、ブラジル

リカルド・フロリアーノ、カリーナ・ダニエル・ペレイラ、アウグスト・ドゥカティ・ルケッシ

WPI、カーボンニュートラル・エネルギー国際研究所 (WPI-I2CNER)、九州大学、福岡県、819-0395

カヴェ・エダラティ

サンパウロ州立大学 (UNESP) 生物科学研究所、リオクラロ、サンパウロ、ブラジル

アウグスト・ドゥカティ・ルケッシ

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RF: 概念化、方法論、検証、論文作成。 KE: 概念化、方法論、検証、論文作成。 KDP: 方法論、検証、論文作成。 ADL: 概念化、方法論、検証、論文作成。

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転載と許可

フロリアノ、R.、エダラティ、K.、ペレイラ、KD 他。高圧ねじりによって生成される新しい生体材料としてのチタン-タンパク質ナノ複合材料。 Sci Rep 13、470 (2023)。 https://doi.org/10.1038/s41598-022-26716-8

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受信日: 2022 年 7 月 20 日

受理日: 2022 年 12 月 19 日

公開日: 2023 年 1 月 10 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-26716-8

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