イモリのリンパ系の構造と機能の解析

Scientific Reports volume 13、記事番号: 6902 (2023) この記事を引用

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メトリクスの詳細

イモリやサンショウウオなどの再生能力のある脊椎動物は、リンパ系とリンパ系心臓と呼ばれる血管系との間の複数の接続を特徴とする弱った適応免疫系を持っています。 再生におけるリンパ管構造およびこれらのリンパ静脈接続の役割は不明です。 生体内近赤外リンパ管造影、超短波超音波検査、マイクロ CT リンパ管造影、および組織学的連続切片 3 次元コンピュータ再構成を使用して、Cynops pyrrhogaster のリンパ領域を評価しました。 私たちはモデルと超微細手術を使用して、リンパ心臓がリンパ循環と四肢の再生に必須ではないことを示しました。 代わりに、イモリは、VEGFR-3、LYVE-1、および CD-31 を発現する骨の内部にリンパ管の新規骨内ネットワークを持っています。 しかし、これらの血管による Prox-1 発現を示すことはできませんでした。 私たちは、成体イモリの骨髄がリンパ排液器官と脂肪貯蔵庫の両方として機能することを実証します。 この研究は、尿路動物と哺乳類の免疫系の基本的な解剖学的違いを明らかにし、リンパ管と再生を研究するためのモデルを提供します。

リンパ系は、脊椎動物の免疫系の重要な部分を形成するリンパ管、リンパ組織、リンパ器官のネットワークで構成されています。 リンパ管は組織内の盲端血管として始まり、体全体に広範なネットワークを形成しますが、表皮、軟骨、健康な骨ではまだ確認されていません。 すべてのリンパ管は最終的に、リンパ管と静脈（リンパ管）の直接の接続を介して血液循環に流れ込みます。

リンパ系は、体液、高分子、白血球の利用可能性を制御することで組織内の細胞の周囲環境を調節する機能を持ち、細胞、細胞外マトリックス、血管系の間に重要な架け橋を形成します。 細胞外液輸送におけるリンパ管の役割は伝統的に認識されているが、最近の研究では、リンパ管が創傷治癒、免疫、脂肪代謝、癌転移、心血管疾患および代謝性疾患においても重要な役割を果たしていることが示されている1、2、3、4、5、6。 損傷後にリンパ管構造の再生が失敗すると、リンパ浮腫が生じます。このリンパ浮腫は、進行性の手足の腫れ、脂肪の沈着、蜂窩織炎感染の繰り返しを特徴とする外観を損なう疾患であり、世界中で 2 億人以上が罹患しており、治療法は知られていません 7。

創傷治癒や疾患におけるリンパ系の重要性に関する文献は増えているにもかかわらず、再生におけるリンパ系の役割については十分に研究されていないままです。 その主な理由は、比類のない再生能力により脊椎動物の再生の最良のモデルと広く考えられている有ウロ動物両生類（イモリとサンショウウオ）のリンパ系に関する知識が不足していることです8。 ウロデールのリンパ管に関する現在の知識の多くは、1 世紀以上前に行われた研究と、無尾類（カエルとヒキガエル）の研究から得られた仮定に基づいています9、10、11。

ウロデルのリンパ系は、体の全長に沿ったリンパ管静脈接続部に位置する 8 ～ 23 対のリンパ心臓 (LH) の存在によって特徴付けられ、リンパ管を静脈にポンプで送り、リンパ管への血液の逆流を防ぐ機能を果たします 8,10,12。 LHはイモリに特有のものではありません。 無尾類は 2 ～ 5 対を持っていますが、爬虫類と鳥類は 1 対を持っていますが、ほとんどの鳥類では胎生後早期に消失します10。 一方、哺乳類は LH を持たず、代わりに頸静脈リンパ嚢の発達中に形成される最初の静脈リンパ叢が LH の痕跡ホモログとして記載されています 13,14。 したがって、胎生後の哺乳類には、胸管と鎖骨下静脈の接合部の周囲に位置するすべての四足動物に共通するリンパ管静脈接続が 1 対しかありません。 脊椎動物のリンパ循環におけるこれらの重要な解剖学的差異は、それに応じてリンパ系の機能に重要な影響を及ぼします。

リンパ静脈接続の減少は、脊椎動物の再生能力の低下と顕著に相関しています（補足図i）。 この関係の証拠は、無尾類の生活環においてはっきりと目立ちます。 幼虫のオタマジャクシは、8 対以上の LH を備え、合計で少なくとも 18 のリンパ管静脈接続 (胸管から鎖骨下静脈への接続を含む) を有するウロデルと同じリンパ構造を共有します。 人生のこの段階では、オタマジャクシはウロデールと同様に、尾、手足、目の水晶体を再生する能力を持っています15、16、17。 その後、個体発生上の衰退が起こり、成体として再生不能な状態に移行し、それに対応して LH の数が 2 ～ 5 対に減少します 15,16,17。 南アフリカのツメガエル Xenopus laevis の研究では、ステージ 51 から 52 までのオタマジャクシが切断後に 5 指すべてを備えた完全な後肢を再生できることが示されています 17,18。 これは、ステージ 53 では平均 3.7 桁、ステージ 55 では平均 2.5 桁に徐々に減少し、これに伴い、再生中の組織におけるソニック ヘッジホッグ発現の進行性の損失が伴います 17、18、19。 変態後の後肢の再生は、指や筋肉を欠いた軟骨スパイクの形成に限定されます 18,20。 無尾類や哺乳類などの高等脊椎動物における再生能力の進行性低下の病因は依然として不明であり、この低下は傷害に対する免疫系の反応の違いに起因するという有力な仮説が考えられています20、21、22、23、24。 さらに、これらの複数のリンパ静脈接続の存在が再生を同様に促進するかどうかは不明のままである。

この研究では、日本のアカハライモリ Cynops pyrrhogaster の機能的リンパ解剖学を定義しました。 私たちはモデルを使用して、無尾類とは対照的に、LH リンパ静脈接続がリンパ循環に必須ではなく、再生にも必須ではないことを示しました。 その代わりに、イモリは血管内皮増殖因子受容体 3 (VEGFR-3)、リンパ管内皮ヒアルロン酸受容体 1 (LYVE-1)、および CD-31 を発現するリンパ管の新しい骨内ネットワークを有しており、表層リンパ管ネットワークと深部リンパ管ネットワークを接続し、リンパ循環を維持しています。すべてのLHを切除した後でも。 これは、健康な骨におけるリンパ管に関する最初の報告であり、再生能力の高い尿路動物と哺乳類の免疫系における基本的な解剖学的違いについての洞察を提供します。 この研究はまた、再生におけるリンパ管構造の役割と尿路虫のリンパ管の再生を調査するためのモデルを提供します。

注目すべきことに、ウロデルで使用される解剖学的命名法にはかなりのばらつきがある。 これは主に、ウロデールの血管の解剖学的構造に関する文献が不足していることと、初期の研究者による歴史的に矛盾した発見が今も続いていることによるものです。 1934 年に出版されたフランシスによる画期的な単行本『サンショウウオの解剖学』には、成体サンショウウオの脈管構造のこれまでで最も詳細な解剖学的記述が含まれています9。 したがって、この研究で使用される命名法は、このモノグラフ9に準拠しています。

まず、インドシアニングリーン（ICG）近赤外蛍光透視法（NIRF）リンパ管造影法と超短波超音波検査法（UHFUS）およびマイクロコンピュータ断層撮影法（マイクロCT）造影リンパ管造影法を併用して、生体内でリンパ排水領域を評価しました。 NIRF は分解能は高いですが、組織侵入深度が低く、UHFUS (40 ～ 70 MHz) はサイズと脈動速度の測定に役立ちますが、分解能が比較的低く、浸透深度が低いです。 一方、マイクロ CT では深部リンパネットワークの視覚化が可能となり、NIRF や UHFUS を補完します。 集合リンパ管は、遠くの流れを集める大きなリンパ管として機能的に定義されました。

イモリの背中の肩甲骨から尾の付け根に位置する16対の側方LHを特定し、それぞれLH1からLH16に番号を付けました。 ICG は注射後 2 ～ 5 分で急速に LH に流れ、10 ～ 15 分でピークに達しました。 手足と尾は、明確に定義された集合リンパ管によって特定のLHに一貫して排出されていました（図1a）。 前肢では、リンパ管は肢の背側を腋窩ネットワークの後方に流れ、その後主に LH2 と LH3 に流れ、次に外側縦リンパ幹 (TLyLL) 接続を介して LH1、LH4、LH5 に流れます。 腹側表面のリンパ集合体は、腋窩ネットワークを頭および対側前肢の集合体に接続していました（図1b）。 同様に、後肢では、背部の2つの主要な集合リンパ管が骨盤下部の後方に流れ、その後LH11およびLH12に流れ、その後TLyLL接続を介してLH8、LH9、LH10、LH13、LH14、LH15、および場合によってはLH16に流れ込みます（図1c）。 。 集合血管も前方に走り、正中線を腹側に横切り、総排出腔周囲のネットワークと対側後肢の集合管に接続します。 尾部は、前方に続いてTLyLLを形成し、LH16とその後のLH15に排出される、左右の側尾根に沿って走る2つのコレクターによって排出されました（図1d、e）。

インビボインドシアニングリーン近赤外リンパ管透視法を使用してマッピングされたリンパ管領域。 （a）インドシアニングリーン（ICG）近赤外蛍光透視法（NIRF）を使用してマッピングされたイモリの前肢（青）、後肢（黄色）および尾（緑）のリンパ流領域を示す図。 外側縦リンパ管 (TLyLL) (白い矢印) は体に沿って走り、すべてのリンパ心臓 (LH) (緑色の円) を相互接続します。 (b) 前肢のリンパ管 (青色の矢印) は、密な腋窩ネットワークに向かって前方に流れ、主に LH2 と 3 (緑色の円)、次に LH1、3、5 に流れ込みます。腋窩から集まったリンパ管は腹側表面の正中線を越えて合流します。頭部領域と対側の前肢のコレクター。 ICG 注射部位は赤い矢印で示されています。 (c) 後肢リンパ管 (黄色の矢印) は後方に伸び、主に LH11 と LH12 (緑色の円) に流れ、次に LH8、9、10、13、14、および 15 に流れました。後肢リンパ管は総排出腔の周囲の密なネットワークに接続していました。 尾の右側 (d) と左側 (e) のリンパ管 (緑の矢印) は、それぞれ同側のリンパ管によって排出され、左右の主なコレクターは前方にわずかに異なるコースを走り、TLyLL の形成に進みました。それぞれの側。 尾からのリンパ液は、TLyLL を介して LH16 (緑色の円) に流れ、その後 LH15 に流れ込みました。 (f) ICG NIRFを使用してマッピングされたカエルの前肢(青)と後肢(マゼンタ)のリンパ流領域を示す図。 四肢のリンパ管と LH (緑色の円) を接続する大きな皮下リンパ嚢 (黄色)。 (g) カエルの後肢は、主に背側コレクター (マゼンタの矢じり) によって後部 LH (緑色の円) に排出され、一部の液体が大きな皮下リンパ嚢 (黄色の輪郭) に流れました。 前肢のリンパ管は、後方の LH (青い矢印) に流れる前に、深部のリンパ管構造を覆い隠すリンパ嚢に急速に流れ込みました。 ICG 注射部位は赤い矢印で示されています。 イモリには皮下のリンパ嚢は見られませんでした。

アフリカツメガエルでは、後肢の排液は主に背側コレクターを介して後部LHおよび嚢へ行われました（図1f、g）。 前肢では、ICG が大きな皮下のリンパ嚢に急速に集まり、より小さな血管構造を覆い隠しました。 次に、リンパ嚢からの液体が後部 LH に流れました。 イモリにはそのようなリンパ嚢は見つかりませんでした。 代わりに、過剰な色素は、特に骨盤および腋窩皮下組織の周囲、および内皮で裏打ちされていない神経鞘に沿った血管外空間に収集され、内皮マーカーVEGFR-3、LYVE-1およびCD-31の欠如によって確認されました（補足図ii）。および iii)。 少量の造影剤を注入した場合、これらの空間に液体が集まることは見られず、これらの血管外経路におけるリンパの流れが生理学的循環において限定的な役割を果たしていることが示唆されました。 最長 4 年間追跡調査した動物では、ICG 投与後の死亡や運動や摂食行動の変化は観察されませんでした。

安静時の LH 速度は、心停止期を挟んで 60 ～ 122 bpm で変化し、50 μL の色素の注射後は 72 ～ 156 bpm に増加しました。 各 LH は不規則なリズムで独立して拍動し、隣接する同側または対側の LH 間には同期性はありませんでした。 脈動速度は、すべての LH でほぼ同様でした。 1 つの領域への色素注入は、同じ排液領域を共有せず色素収集のない LH を含むすべての LH の速度の同時増加を引き起こし (データは示されていません)、これは集中的な自律神経系制御を示唆しています。

楕円体数学モデル（図2a）を使用して、UHFUSで駆出率（EF）を推定し、LH心拍出量（LHO）を計算しました（図2b、c）。 平均 EF は 60.40%、EDV 0.026 mm3、LH 速度 117.04 bpm、LHO 1.838 mm3/min、LH あたり 16 ペアすべての合計は 58.816 mm3/min でした。 したがって、イモリは、体重 5 ～ 6 g に相当する量のリンパ液を 1 ～ 2 時間ごとに 10 ml.Kg-1.min-1 の速度で末梢静脈循環に送り出すことが驚くべきことに可能です。

超短波超音波に基づいたイモリのリンパ心臓心拍出量の計算。 (a) リンパ性心臓 (LH) の構造は、リンパ管からリンパ液を受け取り、この液体を外側大静脈に送り出す単一の筋肉室で構成されています。 LH には血液の逆流を防ぐ入力バルブと出力バルブが 1 つずつあります。 コンピューターによる 3D ボリューム再構成により、イモリのリンパ管の心臓の形状は、わずかに尖った出力端と平らな入力端を備えた楕円体状の形状に最もよく一致していることが示されました。したがって、駆出率 (EF) は、2D 超高解像度データに基づいた楕円体数学モデルを使用して計算されました。 LH 拡張末期容積 (EDV) (b) および収縮末期容積 (c)、および LH レートの周波数超音波測定。 平均 EF は 60.40% (SD 12.94)、EDV 0.026 mm3 (SD 0.008)、平均リンパ心拍数は 117.04 bpm (SD 23.12) で、各 LH の LH 心拍出量 (LHO) は 1.838 mm3/min、 16 ペアすべての合計は 58.816 mm3/min です。

深部リンパネットワークを評価するために、マイクロCTリンパ管造影を実行しました。これにより、正中線を横切って肋骨、椎骨、および深部椎骨リンパ管を通って体の対側に向かうリンパ液の流れが示されました（図3a）。 我々は、免疫組織化学と透過型電子顕微鏡（TEM）を利用したコンピューター三次元（3D）ボリューム再構成による連続切片作成を使用して、これらの代替リンパ経路の位置を確認するためにイモリの微小循環を評価しました。 赤血球の除去を確実にし、リンパ管内腔の崩壊を防ぎ、固定を強化するために、リンパ系を介した灌流による固定により血管の3Dボリューム再構築用の組織を準備しました。 経リンパ管灌流による固定は、迅速なリンパ循環、複数の解剖学的リンパ静脈接続、および毛細血管床への双方向の流れを可能にする静脈弁のまばらさを利用して、イモリを適切に固定し、リンパ管の崩壊を防止しました。 有鱗動物は、体幹に沿って縦方向に走る4対の大きな集合リンパ管、LHに沿って走りそれらに直接供給するTLyLL、側腹部と腹側を走る傍腹部縦長リンパ管（TLyLPab）および腹部リンパ管縦管（TLyLPe）を持っています。それぞれ体幹壁の皮下層、および4つの中で最大であり、脊柱のすぐ腹側で体幹の奥深くまで延びる脊椎下縦リンパ管（TLyLSv）です9。

イモリの微小循環と骨髄リンパネットワーク。 (a) マイクロ CT リンパ管造影では、左後肢 (赤い矢頭) に注入された造影剤がコレクター (黄色の矢頭) を通ってリンパ心臓 (LH) (緑の矢頭) に流れ、椎骨に流れて対側のコレクター (青い矢頭) に至る動きを示しました。 ）、対側のLH（マゼンタの矢頭）、および外側縦長リンパ管（TLyLL）（白色の矢頭）。 (b) イモリの体幹全体に繰り返される機能的なリンパ単位。 LH は、TLyLL と、深部リンパネットワークを表在リンパネットワークおよび体の両側の LH に接続する横椎骨内リンパ管 (TvIL) を介して表在リンパネットワークから入力されます。 (c) および (d) リンパ管 (緑) と血管 (赤) を示す連続セク​​ション コンピューター 3D ボリューム再構成。 TvIL (黄色の矢印) は、骨から LH まで流れていることが示されています。 胴体 (c) の前部 LH は、隣接する肋骨により密接に付着していましたが、尾部 (d) では、骨格筋によって骨から分離されていました。 (e) および (f) 腹部肋骨の横突起の骨髄内のリンパ管および血管を示す免疫組織化学 (スケール バー = 100 μm) (e) および尾椎 (スケール バー = 200 μm) (f) ）。 リンパ内皮細胞は、高ローダミン デキストラン取り込みおよび VEGFR-3 + 、LYVE-1 + 、CD-31 + 染色によって同定されましたが、血管内皮細胞は CD-31 + 、LYVE-1 ± 、VEGFR-3- および低ローダミンでした。 -デキストランの取り込み。

リンパネットワークは機能的に、表層真皮および皮下ネットワークと、主に2つを接続する筋肉間中隔で筋肉層を横切るいくつかの小さな血管が見られる深部内臓ネットワークに組織化されました（補足図ivおよびv）。 表層ネットワークには、皮膚の粘液腺および毒腺と密接に関連する微細真皮リンパ叢と、TLyLL、TLyLPab、TLyLPeおよび体分節コレクターを含む皮下神経叢が含まれていました。 深部リンパ管ネットワークには、TLyLSv、リンパ管の脊椎叢、および筋間腔の主要な血管および神経に沿って走行し、腹腔内および胸腔内の深部内臓リンパ管と結合し、最終的に主要な静脈から血液心臓に流れる深部血管が含まれていました。 表皮にはリンパ管は見られませんでした。 同様に、表皮には血管は観察されなかった。 その代わりに、血管は非常に豊富な緻密な表皮下神経叢を形成しました。 筋肉には、表在血管と深部血管を繋ぐ広範な血管網もありました。 LH 出力を受信する外側静脈 (VL) は、TLyLL に沿って皮下層を走行します。

我々は、LHには表在リンパ管を集めるTLyLLと、TLyLSv深部リンパ管に接続する骨内の新規骨内リンパネットワークという2つの主要な入力があることを発見した（図3b）。 骨内リンパ管ネットワークは、椎骨横突起内の椎骨横骨内リンパ管（TvIL）と我々が名付けた1つの主要な集合リンパ管と、VL LH出力を椎骨下静脈叢に接続する1〜2本の静脈を伴う肋骨から構成されていました。これらは横椎骨内静脈（TvIV）です（図3c、d、ビデオ1および2）。 TvIL と TvIV は両方とも、骨膜と周囲の筋肉に接続する骨髄内部のネットワークを形成する小さな枝と支流を持っていました。 静脈には著しく多くの支流があり、血液の流れを内側の椎骨下静脈叢に向ける複数の弁の存在によって特徴づけられました。 LH の入力端と出力端にある 2 つの弁を除けば、リンパ管構造には他の弁は見られず、双方向の流体の流れとリンパ循環の変化への迅速な応答が可能になっています。

機能的な骨内リンパネットワークの存在は、VEGFR-3 + 、LYVE-1 + 、CD-31 + 血管におけるローダミンデキストラン色素の取り込みによって確認されました（図3e、f）。 TEM 分析（図 4a ～ d）でも、骨髄内のリンパ管の超微細構造が確認され、血管と対比されました 25。

骨内のリンパ管と静脈、およびリンパ系心臓の超微細構造。 (a) イモリの腹部肋骨の樹脂包埋トルイジン ブルー染色スキャン切片。椎骨横骨内リンパ管 (TvIL) (b) および椎骨横骨内静脈 (TvIV) (c) 骨髄内と隣接するリンパ心臓 (c) LH) (d)。 透過型電子顕微鏡により、TvIL ((b) スケール バー = 2 μm) および LH ((d) スケール バー = 20 μm) がリンパ内皮細胞 (LEC) で裏打ちされており、リンパ管内皮細胞の特徴的な超微細構造的特徴 (LEC) が存在しないことが確認されました。周皮細胞、薄い壁、高度に弱毒化された LEC 細胞質 (緑色の矢印 (b))、まばらな密着結合、少数の接着結合、LEC 間の時折のスペース (黄色の矢印 (b および d'))、および重複する葉状内皮細胞結合 (青色)矢印 (d'))。 特殊化された LH 筋は、心筋と骨格筋の両方の特徴を備えていました (白い矢印 (d'))。 対照的に、TvIV ((c) スケール バー = 5 μm) は血液内皮細胞 (BEC) で裏打ちされており、より厚い壁を持ち、周皮細胞 (マゼンタの矢印 (c)) に囲まれ、いくつかの密着結合と接着結合 (赤い矢印 (c) ))、複数の細胞質小胞がありました。 血管内にも赤血球が見られました。

この構造は、TLyLLを介して末梢身体セグメントからLHにリンパ液を運ぶ表在リンパ管コレクター、深部リンパ管とLHの間でリンパを輸送するTvIL、およびVLにリンパ液を送り出すLHからなる基本的な機能的リンパ単位を形成する。これをイモリの幹全体に沿って繰り返しました（図3b）。 上肢、胸部、腹部を流れる前リンパ管では、TvIL は肋骨の内側を流れ、LH のより大きく支配的な入力血管でしたが、尾部では後肢と尾を流れる表層コレクターが優勢でした。 前部 LH (ビデオ 1) は、隣接する肋骨の後面にもより密接に付着していましたが、尾部 (ビデオ 2) では、骨格筋によって分離された骨からわずかに離れて位置していました。 前肢と後肢のすべての骨、首の肋骨と椎骨、胴体と尾近位、肩帯と骨盤帯の連続切片分析により、イモリの骨髄は血管が多く、細胞が少なく、広範囲に脂肪組織で満たされていることが示されました（補足）図viおよびvii）。

LH は無尾類のリンパ循環に不可欠です 13,26,27。 麻酔やアブレーションによってその機能を実験的に中断すると、カエルやヒキガエルは 2 ～ 4 日で血液濃縮、浮腫が起こり、必然的に死に至ります 13,26,27。 イモリとアフリカツメガエルの示差的な LH 機能を評価するために、段階的な超微細手術による LH 切除を実施しました。 以前の報告13、26、27と一致して、アフリカツメガエルの2対の後部LHの切除は、無傷の前部LHが存在するにもかかわらず、すべてのカエルで浮腫、18〜29％の術後（PO）体重増加、および12時間以内の死亡を引き起こした。 (補足図viii)。 興味深いことに、領域または16対のLHすべてのLH切除後の1か月から1年間の観察期間中に、どのイモリも浮腫を発症したり、行動の変化、または死亡したりしませんでした（図5a）。

リンパ心臓切除後のリンパ循環の生理学的変化。 (a) イモリのリンパ性心臓 (LH) 切除は、浮腫、組織学的変化、死亡を引き起こしませんでした (スケール バー = 1 mm)。 術後 1 週間 (PO) の四肢の直径に有意差はありませんでした (近位 t(9) = 0.729、p = 0.485、中間 t(9) = − 0.504、p = 0.627、遠位 t(9) = 0.297 、p = 0.773)、LH 切除イモリと対照の間で評価者間信頼性は良好で、ICC = 0.893、95% CI (0.825、0.934) でした。 （ b ）マイクロCTリンパ管造影では、PO90日目のLH切除イモリの血液循環におけるリンパコントラストの低下が示され、傍腹部縦断リンパ管（TLyLPab）側副流が見られました（黄色の矢印）。 後大静脈（VCP）分析により、LH 切除イモリの平均灰白値は対照よりも有意に低いことが示されました（t（34） = − 3.156、p = 0.003）。 (c) リンパ管から静脈への流れのローダミン デキストラン蛍光リンパ管造影分析 (スケール バー = 100 μm) も、28 日目でリンパ液を受け取る血管の密度の有意な減少を示しました (t(188) = 13.057、p < 0.001)。すべてのLHの切除後、これはPO 120日目に正常に戻りました（t（161）= - 0.854、p = 0.394）。 （ d ）超短波超音波検査では、両側後部 LH 切除を行ったイモリの LH 率の有意な増加（t（12） = − 2.707、p = 0.019）が示されました。 (e) LH の切除後、側副血流によりリンパ循環が維持されました。 TLyLPab側副枝（黄色の矢印）が、TvILへの接続（マゼンタの矢印）とともに示されている。 これらの結果により、LH切除により末梢リンパから静脈への流れが90日間正常に停止され、その後正常なリンパから静脈への流れがPO120日までに回復したことが確認された。 データは平均値 ± 標準偏差 (エラーバー) を表します。

リンパ管から静脈への流れの定量的評価は、後大静脈（VCP）の定量的マイクロCT（図5b）とリンパ管からローダミンデキストラン色素を受け取った筋肉内の血管の密度を測定することによって実行されました（図5c）。 VCP はイモリにおいて一貫した経過をたどる主要な鉱脈です。 他の主要な静脈とは異なり、VCP は筋肉内の血管と同様に複数の太いリンパ管を伴って​​おらず、末梢リンパ液から静脈への流れを研究するのに理想的なものであることがわかりました。 LH 切除イモリでは、PO 28 日目 (p < 0.001) と 90 日目 (p = 0.003) でリンパから静脈への流れが著しく低下し、120 日後には正常値に増加しました (p = 0.394)。LH 切除によりリンパ静脈の流れが効果的に停止されたことが確認されました。接続が失われ、リンパから静脈への流れが減少します。

なぜイモリがLH切除後にリンパ機能障害の症状を発現しなかったのかを調べるために、LHの一部またはすべてを切除した後に生理学的循環評価を実施しました。 UHFUSは、後部LHを切除したイモリの残りの前部LHのポンピング速度が対照よりも有意に高いことを示した（図5d）。 この代償的な LH 活性の増加により、各 LH の出力もそれに応じて 20% 増加しましたが、残りの 9 対の合計出力 (41.454 mm3/分) は依然として正常なイモリの合計出力よりも低かったです。 LH切除イモリのマイクロCTリンパ管造影では、皮下面で縦方向に走り、リンパ液をTvILに輸送する側副リンパ管の拡大が示されました（図5b、e）。

LHが再生するかどうかを確認するために、単一および複数のLHを完全に切除した後、連続的なin vivo顕微手術解剖、UHFUSおよびマイクロCTリンパ管造影を実施しました。 再生は一貫して 5 つの形態学的段階をたどりました (図 6a–e)。 血栓の解決後、最初の 28 ～ 60 日の PO で、強力な血管新生と主要血管構造の回復が初めて観察されました（図 6a ～ e）。 これに続いて、PO 50〜80日でリンパ管新生（図6e、f）、PO 100〜130日でLHの完全再生（図6g）が行われ、より尾側のLHは完全に再生してポンピングを再開するのにわずかに時間がかかりました。より多くの頭蓋幹LH。 再生されたLHは、ローダミンデキストラン色素の取り込みによって実証された、完全に機能する弁と流れを含む、元のLHと同一のサイズ、形状、構造、位置、および機能を有していた（図6gおよび7）。 新しく再生されたリンパ内皮細胞 (LEC) は、VEGFR-3、LYVE-1、および CD-31 を強く発現していました (図 7)。

完全切除後のリンパ系心臓再生の形態学的段階。 (a) 正常なリンパ心臓 (LH) (マゼンタの矢頭) とその供給神経 (青色の矢頭)、外側縦長リンパ管 (TLyLL) (黒色の矢頭)、および外側静脈 (VL) (赤色の矢頭)。 LH 機能は、ローダミン - デキストランの収集によって確認されました (スケール バー = 100 μm)。 (b) LH 切除直後の組織欠損。 LHと密接に関連するTLyLL、VLおよび供給神経の一部も切除した。 (c) ステージ 1 術後 (PO) 5 ～ 10 日目: 血餅形成に続いて、創傷表皮の下に柔らかく脆弱な組織塊が蓄積しました。 (d) ステージ 2 PO 28 ～ 40 日目: VL の切断端と他の主要な血管を相互接続するいくつかの小さな血管の血管新生。 損傷部位にリンパ管新生は見られません。 組織学的検査では、筋肉と線維芽細胞の再生が示されましたが、機能的なリンパ管は示されず、ローダミン デキストランは収集されませんでした。 （e）ステージ3 PO 50〜60日目：血管が成熟して元のサイズと構造を回復し、VL連続性が回復します。 小さなリンパ管が創傷の端から損傷領域に向かって発芽しているのが観察された。 （ f ）ステージ4 PO 80〜100日目：活発な流れと色素の収集を伴うリンパ管の成熟が、元のLHの領域で嚢胞性塊として観察されましたが、脈動はありませんでした。 (g) ステージ 5 PO 100 ～ 130 日目: 脈動を伴う完全な LH 再生。 再生された LH は完全に機能する入力および出力バルブを有し、ローダミン デキストランを取り込み、完全に機能することを確認しました。

新しく再生されたリンパ管におけるリンパ内皮細胞マーカーの発現。 完全な顕微手術切除から 120 日後の腹部領域の再生されたリンパ性心臓 (LH) (黄色の矢印) と隣接する肋骨 (青色の矢印) を示す組織切片。 新しく再生された LH は、元の LH と同一の形状、サイズ、構造、位置、および機能を持っていました。 さらに、新たに再生された LH は、リンパ内皮細胞マーカー VEGFR-3 および LYVE-1、および汎内皮マーカー CD-31 の強い発現を示しました。 ローダミン デキストラン色素の取り込みにより、リンパ管が完全に機能していることが確認されました (スケール バー = 200 μm)。

後肢リンパモデルを使用して、四肢再生における LH リンパ静脈接続の機能を評価するために、ランダム化比較試験が実施されました。 研究対象のイモリではLH9からLH15までの増分超微細外科的切除を実施し、対照では偽手術を行った後、左後肢切断を行った（図8a）。 2 つのグループは、鼻から尾までの平均長さが類似しており、研究グループ (101.55 mm、SD 4.57) と対照 (101.97 mm、SD 4.82) t(60) = − 0.352、p = 0.726、および平均体重も同様でした。群（5.37 g、SD 1.22）および対照（5.45 g、SD 1.17） t(60) = − 0.245、p = 0.808。 すべてのイモリは割り当てられた実験的治療を受けました。 追跡調査は52匹のイモリで完了し、10匹のイモリ、4匹の研究と6匹の対照のイモリは麻酔から完全に回復できず、手術後に死亡したが、この差は有意ではなかった、p = 0.732。 研究対象のイモリと対照の間で、各再生段階に到達するのにかかる時間に有意差はなかった。 デジタル伸長段階のエンドポイントに到達するまでの平均日数は、研究グループで47.81日（SD 8.56）、コントロールで47.52日（SD 10.137）でした、p = 0.773（図8b）。 さらにサブグループ分析を行ったところ、片側LH切除と両側LH切除の間、およびLH切除と同日の切断と1週間遅れの切断の間に統計的に有意な差は示されませんでした（図8c-i）。

四肢の再生率と形態に対するリンパ性心臓切除の結果を評価するランダム化対照試験。 (a) ランダム化対照試験デザイン: n = 62 匹のイモリが登録され 4 つのブロックに分けられ、各ブロックは盲検の独立した助手によって研究グループと対照グループにランダム化されました。 52匹のイモリの追跡調査が完了し、10匹のイモリが術後すぐに死亡した。 （ b ）研究グループと対照グループの間で全体の再生率に統計的に有意な差はありませんでした（コルモゴロフ・スミルノフ Z = 0.662、p = 0.773）。 （ c – h ）サブグループ分析では、切断のタイミングに関係なく、片側LH切除後の研究イモリと対照イモリの間の再生率に統計的に有意な差がないことも示されました（コルモゴロフ–スミルノフZ = 0.730、p = 0.660）。LH直後の切断切除（コルモゴロフ-スミルノフ Z = 0.617、p = 0.841）および切断は LH 切除後 1 週間遅れました（コルモゴロフ-スミルノフ Z = 0.661、p = 0.774）。 同様に、即時切断（コルモゴロフ・スミルノフ Z = 1.284、p = 0.074）のタイミングに関係なく、段階的両側 LH 切除後（コルモゴロフ・スミルノフ Z = 0.778、p = 0.579）、研究イモリと対照イモリの間に有意差は見つかりませんでした。切断は 1 週間後 PO で遅延した (コルモゴロフ – スミルノフ Z = 1.193、p = 0.116)。 （i）異なる実験バッチ（対照を除く）からのLH切除研究イモリの比較でも、再生が完了するまでにかかる時間に有意差は示されませんでした（Kruskal-Wallis H（3）= 0.1.229、p = 0.746）。 (j) 再生された四肢の形態学的異常の比較では、研究イモリと対照イモリの間に統計的に有意な差は示されませんでした (p = 0.150)。 データは平均値 ± 標準偏差 (エラーバー) を表します。

対照と比較して、研究グループの再生四肢に異常を発症したイモリの数は少なかったが、この差は統計的に有意ではなかった（図８ｊ）。 観察された最も一般的な四肢の異常は、指の重複 (n = 6 イモリ) と指の欠落 (n = 4 イモリ) でした。

リンパ浮腫のリンパ管再建顕微手術では、血管のアンギオソームと同様に、リンパ管構造も広範な相互接続にもかかわらず、機能単位に組織化されており、特定のリンパ管コレクターが組織領域の特定の 3 次元ブロックを優先的に排出していることが確立されています。リンパソーム28、29、30。 これらの領域を定義することは、機能解剖学、発生学的発達、顕微手術治療の理解、およびリンパ系の実験モデリングにとって不可欠です。 この研究では、イモリの機能的リンパ解剖学的構造を評価し、表層リンパネットワークと深層リンパネットワークを接続する骨髄内部の新しいリンパネットワークを明らかにしました。 我々は、モデルと高精度超微細手術を使用して、イモリやその他の再生能力の高い脊椎動物のリンパ系と免疫系の重要な特徴である複数のLHリンパ静脈接続（補足図i）が再生に必須ではないことを示しました。 さらに、我々は、イモリが特徴的な段階的プロセスで完全に切除された後、完全に機能するLHを再生できることを実証した。 したがって、イモリは、再生におけるリンパ管構造の役割とリンパ管の再生の両方を研究するための有用なモデルを提供します。 ただし、この研究で見つかった有尾類、無尾類、哺乳類の間の顕著な解剖学的差異は、結果を解釈する際に考慮する必要があります。

歴史的に、リンパ管の研究は血管の研究に比べて遅れをとっていました。リンパ管は一般に小さく、造影剤を使用しないと視覚化することが難しく、多くの分子マーカーが血管と共通しているため、LEC マーカー Prox-1 が登場するまでは識別が困難でした。 VEGFR-3、LYVE-1、ポドプラニン。 パニッツァは 1883 年に造影剤として水銀を使用してサンショウウオのリンパ管を研究した最初の研究者でしたが、これはその重量により大きなリンパ腔の変形を引き起こすとして強く批判され、液体および半ゼラチン状の染料に置き換えられました 9,10。 これらの方法は生体内での使用には適しておらず、機能的なリンパの解剖学的構造についてはほとんど明らかにされませんでした。 我々は、主要なモダリティとしてICG NIRFを使用し、UHFUSおよびマイクロCTリンパ管造影法を補完して、生体内でイモリの前肢、後肢および尾のリンパ領域を定義し、LH切除後のリンパから静脈への流れの減少を示すことでモデルを検証しました。 これらの領域は再生研究で最も広く使用されているため、リンパモデルを作成するために選択されました。 私たちがイモリとカエルの両方で観察したNIRFの主な制限は、それらの黒い皮膚の色素が近赤外線を吸収することです。 したがって、トランスジェニックアルビノ動物を使用する必要があり、サンプルサイズが制限されました。

私たちの調査結果は、ウロデルのリンパ系が無尾類とはかなり異なることを示しました。 イモリのLHで我々が発見した60.40%のEFは、無尾類で報告されている20〜80%に匹敵したが、イモリのLH率とEFは動物の覚醒状態によって大きな変動を示さなかった26,31。 得られたイモリの 16 対すべての LH ペアの合計出力 10 ml.Kg-1 min-1 も、すべての無尾類 LH を流れる推定 0.9 ～ 5 ml.Kg-1 min-1 の 2 倍でした 26。 逆説的ですが、無尾類とは異なり、イモリでは完全な全身麻酔も一部またはすべてのLHの完全切除もリンパ機能不全や死亡を引き起こさず、代わりに側副血流が急速に動員され、循環が回復しました。 一部の主要なリンパ管収集器の遮断後の側副細胞の補充は、無尾類を除く他のほとんどの脊椎動物に共通しています。 この点において、有尾動物のリンパ系は、成体無尾類よりも他の脊椎動物クラスと解剖学的に類似点が多い。 さらに、我々はイモリが成体の無尾類に特徴的な大きな皮下リンパ嚢を持たないことを示した10,32。 無尾類のユニークな生物学の結果は、無尾類のリンパの流れが、リンパ嚢への末梢リンパの流れに関して筋肉の動きと肺換気に大きく依存しており、血液循環へのリンパ液の排出に関しても同様に LH に依存していることを意味します。 したがって、無尾類のリンパ系は、進化の進行の排他的な両生類モデルではなく、無尾類の固有の身体構造のニーズを満たすための高度に特殊化された陽動的な適応を表しています。

驚くべきことに、我々は、正常なイモリの骨髄において、表層リンパ管網、より大きな深部椎骨叢およびLHを接続する新規の骨内リンパ管網を同定した。 これらの血管が骨腔を優先的に通過することにより、血管内腔の崩壊に対する機械的保護が提供されます。 この広範なネットワークは、すべての LH を除去した後でもリンパ循環を維持し、イモリのリンパ機能不全を防ぎました。 特に、さまざまな実験条件下で複数回の試みにもかかわらず、Prox-1 発現を LEC の同定に利用できませんでした。 したがって、リンパ管の存在を包括的に実証するために、内皮細胞VEGRF-3およびLYVE-1発現分析、TRITC-デキストラン色素注入研究、およびTEM分析によってサポートされるマイクロCTリンパ管造影と連続切片コンピューター3D再構成を組み合わせたマルチモーダルアプローチを採用しました。椎骨と肋骨のネットワーク（図3および4）。 ただし、脊椎、肋骨、および長骨のVEGFR-3+およびLYVE-1+血管のリンパ同一性を決定的に証明するには、Prox-1染色が依然として必要です（補足図v）。

多くの脊椎動物においてリンパ系の重要な一次リンパ器官であるにもかかわらず、骨内のリンパ管構造は、血管骨腫瘍や広範な原発性および二次性の悪性骨腫瘍を含む病態でのみ確認されています33、34、35。 リンパ管に対する哺乳類の骨嫌悪感は、ゴーハム・スタウト病で最も劇的に強調されます。ゴーハム・スタウト病は、骨内にリンパ管が出現し、高度に破壊的かつ進行性の骨吸収を引き起こし、影響を受けた骨が完全に消失することを特徴とするよく理解されていない疾患です。 私たちの結果は、リンパ管の存在にもかかわらず、成体のイモリの骨は一次リンパ器官でも二次リンパ器官でもなく 37,38 、代わりにイモリの重要なリンパ排液器官および脂肪貯蔵庫として機能することを示しています。 私たちは、リンパ管がこの骨髄脂肪貯蔵の代謝と動員においてさらに機能しているのではないかと推測しています。

自然免疫系とは異なり、イモリの再生における適応免疫系の役割はほとんど理解されていません。 アホロートルにおける scRNA-seq の解析により、四肢再生の重要な段階における T 細胞マーカーおよび B 細胞マーカーである tac および igll5 が一貫して同定されています 39,40,41。 しかし、イモリのリンパ系血管系の主要構成要素の切除後の再生に有意な変化がないことを示す我々の結果は、最大の二次リンパ器官である脾臓の切除に関する以前の報告と一致しており、適応免疫応答が再生に必須ではない可能性を強く示唆しているしかし、その代わりに規制の役割を担うこともあります42。

リンパ浮腫は、リンパ管構造の機能障害の直接の結果です。 手術や化学放射線療法による損傷後のリンパ再生不全の背後にある正確なメカニズムは依然として不明です43。 TGF-β1 媒介の瘢痕化および線維化、ならびに硬化および集合リンパ管のポンプ作用の喪失は、リンパ浮腫の病態生理学における進行段階として認識されています 43,44。 LH を除けば、両生類のリンパ管には、哺乳類の集合リンパ管に見られる筋肉の脈動壁と弁の両方がありません 45。 この特性により、LH はヒトの集合リンパ管の構造的および機能的側面をモデル化するのに理想的になります。 注目すべきことに、哺乳類のコレクターに見られる平滑筋とは異なり、イモリのLH筋組織は骨格筋と心筋の特徴を共有しています13,46。 我々は、イモリが完全切除後にLHを再生できることを示した。 新たに再生された LEC における VEGFR-3 の高発現は、哺乳類と同様に、イモリのリンパ系再生も VEGF-C/VEGFR-3 経路に依存している可能性があることを示唆しています 47。 私たちは、神経供給の損傷が、より尾側のLHがポンプ活動の再開を遅らせた理由である可能性があると推測しています。 カエルを使った研究では、除神経後に LH のポンプ機能が回復するまでに 20 ～ 30 日かかることが示されました 46。 観察されたリンパ管に先行する血管系の再生は、血管から発芽する Prox-1 を発現するリンパ管の発生学的発生を彷彿とさせます 48,49。 今後の研究では、再生中のLHにおけるLECの発生源、Prox-1、LYVE-1、VEGFR-3、SOX18およびリンパ管形成に関連するその他の因子の時空間的発現の差、および完全回復に影響を与える因子に焦点を当てる必要がある。ポンプ活動の様子。

臨床的には、血管新生リンパ節転移におけるリンパ管静脈吻合術（LVA）の顕微手術による単独または遠心性LVAとしての作製は、現在、リンパ浮腫およびリンパ流障害の主要な外科的治療法として広く考えられています50、51、52、53。 これらは、イモリの自然な LH リンパ静脈接続とよく似た機能を果たします。 したがって、我々はこれらの接続に研究を集中させました。なぜなら、これらの接続は、体液循環を超えて患者の潜在的な治療効果を外科的に変換するための容易に利用できる機会を提供するからです。 この研究で発見されたリンパ静脈接続と再生との関連性の欠如は、LVA後の組織治癒の生物学についての予備的な洞察を提供する。 しかし、イモリのLHリンパ管と骨内リンパ管との密接な関連性は、ヒトには本来存在しないものであり、結果的にイモリとヒトのリンパ生理学における違いを思い出させるものとなっている。 この骨内リンパネットワークの免疫学的および代謝機能に取り組むことで、人間の骨におけるリンパ管の進化的欠如、疾患、免疫、脂肪代謝、そしておそらくは再生におけるリンパ管の役割についての洞察が得られる可能性があります。

野生型およびトランスジェニックアルビノの成体日本アカハライモリ Cynops pyrrhogaster (鼻から尾までの長さが 90 ～ 120 mm) を筑波大学生命環境科学部から入手しました 54。 野生型およびアルビノの南アフリカツメガエル Xenopus Laevis を地元のペット ショップから入手しました。 野生型イモリとすべてのカエルは三重大学形成外科学教室で飼育され、アルビノイモリは筑波大学生命環境科学研究院で飼育されました。 動物を含むすべての実験は、三重大学動物管理委員会および筑波大学動物管理利用委員会によって承認されたガイドラインおよび規則に従って実施されました（登録コード 170110）。 すべての方法は、ARRIVE ガイドライン 2.055 に従って実行および報告されました。

動物は、実験手順の前に室温で 1 ～ 2 時間、0.1% FA100 溶液 (4-アリル-2-メトキシフェノール; DS Pharma Animal Health、大阪、日本) の水溶液で麻酔を受けました 56。

ICG NIRF リンパ管造影は、トランスジェニック アルビノ イモリ 54 (n = 9 匹のイモリ) およびアルビノ カエル (n = 3 匹のカエル) に対して実施されました。 注射用滅菌水で希釈した 1:1000 溶液 Diagnogreen 25 mg/ml (第一三共、東京、日本) 10 ～ 20 μL を 34G 針を使用して皮下注射し、正常な生理学的条件下でのリンパ流を評価するために 50 μL を使用しました。過剰な組織液の排出を評価するために使用されます。 手 (前肢) と足 (後肢) の背側および腹側表面、および尾の遠位 10 ～ 15 mm の左側と右側の注射をそれぞれ個別に評価しました。 リンパの流れは、動物から 15 ～ 25 cm 離れた高倍率で PDE Neo NIRF カメラ (Hamamatsu Photonics、浜松市、日本) を使用して視覚化および記録されました。

免疫組織化学は、Casco-Robles et al.57 によって以前に記載されているように実行されました。 簡単に説明すると、サンプルを PBS、PBS 中の 0.2% TritonX-100、および再度 PBS でそれぞれ 15 分間洗浄し、ブロッキング溶液 (2% 正常ヤギ血清 (S-1000; Vector Laboratories、バーリンゲーム、カリフォルニア州、米国)/0.2) 中でインキュベートしました。 % TritonX-100 in PBS) で 2 時間洗浄し、前と同様に洗浄し、次にブロッキング溶液で希釈した一次抗体中でインキュベートしました。 VEGFR-3染色には、PBSの代わりにtTBSを使用した。 蛍光色素研究は、注射用滅菌水で再構成したテトラメチルローダミン デキストラン 2,000,000 MW (Invitrogen D-7139) を 20 ～ 50 μL 皮下注射し、10 ～ 15 分後に組織サンプルを採取して実施しました。 リンパ管は、ローダミン デキストラン取り込みの差異と VEGFR-3、LYVE-1、および CD-31 の染色の差異を比較することによって同定され、血管と区別されました。 LECはVEGFR-3 + 、LYVE-1 + 、CD-31 + として同定され、BECはCD-31 + 、LYVE-1 ± 、VEGFR-3-として同定された。 成熟成体イモリにおいて市販の Prox-1 抗体で染色することによるリンパ管の追加の同定をさまざまな実験条件下で試みましたが、これは成功しませんでした (データは示さず)。 組織像は、Keyence BZ-X710 顕微鏡および Olympus DP74 顕微鏡デジタル カメラと組み合わせた Olympus AX80 を使用して撮影されました。 画像処理はImage J58,59を用いて行った。

次の抗体を購入しました：抗 LYVE-1 Novus (NB600-1008)、Anti-CD-31 Bioss (BS-0195R)、Anti-LYVE-1 Abcam (Ab14917)。 抗VEGFR-3抗体はイモリヌクレオチドオーソログを基にユーロフィンズジャパン社が特注で作製した。 使用した抗体の詳細は補足データに記載されています。

麻酔後、50μLのICG色素をイモリとカエルの手足または尾に皮下注射した。 No.15 外科用メスを使用して、切除対象の LH を覆う側線隆起のすぐ下で背中の皮膚を縦方向に切開し、スーパーマイクロサージャリー解剖技術と OMS を使用して幅 2 ～ 3 mm の皮膚弁を皮下面に持ち上げました。皮膚血管穿孔部を保存するための 800 および OMS 610A 手術顕微鏡 (Topcon、東京、日本)。 LH は、脈動と ICG 色素の収集によって視覚的に識別されました。 スーパーマイクロサージカル技術とスーパーマイクロサージャリーチタン器具（EMIファクトリー株式会社、長野県）を使用してLHを切除し、研究グループでは周囲の組織を注意深く保存しましたが、対照では同じ手術が行われましたが、LHは無傷のまま残されました。 断続ナイロン10/0縫合糸を使用して皮膚弁を閉じた。

合計62匹のイモリがランダム化対照試験に登録され、LH増分切除後の再生と1週間POでの循環変化の発症後の再生を評価するように設計された4つのブロックに分けられました。 次に、SPSS 26 を使用し、盲検で独立した助手 (HPB 外科部門から) によってイモリをほぼ同じ実験グループに無作為に割り付けました。 独立した T 検定を使用して、2 つのグループの平均鼻先から尾までの長さと重量を比較しました。 下肢を排出する 7 つの LH がすべてのイモリで同定され、研究グループでは上記の超微細手術技術を使用して切除されましたが、対照では同様の解剖が行われましたが、LH は無傷のまま残されました。 No.10 外科用メスを使用して左後肢を膝関節の 2 mm 近位で切断し、突出した大腿骨を傷と面一に切り取りました。 止血を達成するために、数分間穏やかな圧力を加えた。 実験的治療の外科的性質により、研究者の盲検化は不可能であった。 ただし、偏見を制限するために、割り当てられたグループは、創傷の露出とリンパの顕微解剖後にのみ顕微外科医に明らかにされました。 イモリは室温で別々のプラスチック容器に餌を与えずに保管し、毎日観察し、再生の形態学的段階を記録した60。 我々のオリジナルのプロトコールは、盲検化された3人の研究者による四肢の再生時間を評価することを計画していました。 ただし、2020 年から 2021 年の間はスタッフの確保が限られていたため、このプロトコールからは外れ、代わりに 1 名の非盲検研究者がこの評価を実施しました。 2サンプルコルモゴロフ-スミルノフ検定を使用して、研究グループと対照グループの間で再生率を比較しました。 クラスカル・ウォリス検定は、研究グループの LH 切除イモリのサブグループ分析に使用されました。 再生された四肢の形態の評価は、盲検の研究者 2 名によって行われました。 Fisher Exact Test を使用して、形態学的に異常な再生四肢と PO 死亡の割合を比較しました。

イモリ (n = 6 研究グループのイモリ、n = 5 対照イモリ) では、左後肢の直径を 3 点で測定しました。 足首関節の近位、膝関節および大腿部で 3 mm、膝の近位 2 mm、LH 切除後 1 週間、独立した盲検助手 2 名による。 クラス内相関係数は、平均評価 (k = 2)、絶対一致、二元混合効果モデルに基づいて計算されました。 カエル (n = 2 匹) の場合、カエルをペーパータオルで軽く叩いて水分を取り除き、デジタル微量天秤を使用して総体重を測定しました。

ローダミン デキストラン陽性筋肉内血管の密度は、各イモリの尾の付け根、腹部、胸部の 24 ～ 36 個の異なるパラフィン断面で 20 × 視野内の血管の数を計数することによって評価されました。 N = 3 匹のイモリをすべての LH 切除後 28 日目に評価し、n = 1 匹のイモリを 120 日後に評価し、n = 3 匹の対照イモリを偽手術後 28 日および 120 日後に評価しました。 独立した T 検定を使用して、グループ間の血管密度を比較しました。

マイクロ CT リンパ管造影は、10 ～ 50 μL イオヘキソール (Omnipaque® 300、GE Healthcare Pharma、東京、日本) の皮下注射前および皮下注射の 10 ～ 60 分後に、CosmoScan GXII (リガク、東京、日本) を使用して実行され、画像は RadiAnt を使用して処理されました。 DICOM ビューア ソフトウェア。 VCP の定量分析は、Image J59 を使用して実行されました。 VCP の断面の平均灰色値は、各イモリの骨盤から肝臓までの経路に沿った 6 つの異なる点で測定され、独立した T 検定を使用して研究 (n = 3 匹のイモリ) と対照 (n = 3 匹のイモリ) を比較しました。イモリ3匹）のグループ。

20〜50 μLの注射の前後に、VeVo MD UHF70（富士フイルムビジュアルソニックス、富士フイルム、東京、日本）を使用して、6匹のイモリ（n = 2の正常なイモリ、n = 2のLH切除イモリ、n = 2の制御操作イモリ）に対してUHFUSを実行しました。手足に生理食塩水を注入する。 2 匹のイモリからの合計 n = 8 個の LH を使用して、LH EF を計算しました。 2 匹の研究イモリからの合計 n = 3 LH、および 1 匹の対照イモリと 2 匹の正常なイモリからの n = 11 LH を、独立した T 検定を使用した後部 LH 切除後の LH 速度補償の比較に使用しました。

単一の LH 切除 (n = 5 イモリ) では、2 × 4 × 2 mm の皮膚弁を近位尾部で持ち上げ、単一の LH を上記の超微細手術技術を使用して切除しました。 再生は、150 日間、毎週、次に毎月の間隔で皮膚弁を開くことによって評価されました。 複数の LH 切除では、LH の 16 対すべての切除後の n = 1 匹のイモリと、四肢再生実験からの研究グループのイモリ n = 16 匹を、LH が切除された領域に沿って皮膚弁を開いて 100 日から 150 日後に観察しました。マイクロCTリンパ管造影を使用します。 テトラメチルローダミン - デキストランリンパ管造影および IHC を、28 日 (n = 3 イモリ) および 120 日 (n = 1 イモリ) の連続組織切片に対して実施しました。

FixLyP は、連続スライドのコンピューター 3D ボリューム再構築に備えて、血管から赤血球を除去し、リンパ管を固定してリンパ管の崩壊を防ぐために実行されました。 腹膜を貫通しないように注意しながら、正中線の腹部皮膚切開を行った。 手術用顕微鏡を使用して、VCP (直径 0.3 ～ 0.5 mm) が骨盤から肝臓へ上昇し、腹膜のすぐ奥にあることが確認されました。 腹膜を開き、小さなサイズの微小血管クランプを近位および遠位に適用し、静脈が肝臓に入る前に５ｍｍ切断した。 静脈の橈側端は、外膜を切除するための標準的な顕微手術技術を使用して準備されました。 次いで、微小血管の丸い先端が鈍い血管針を静脈の橈側端に挿入し、血管クランプを解放した。 4℃の冷ヘパリン生理食塩水を、1 mlの注射器を使用して静脈にゆっくりと注入し、肝臓の色が白っぽくなり、透明なヘパリン生理食塩水の排出が見られるまで、静脈の尾端から自由に出血させました。 次に、4℃の冷4%パラホルムアルデヒド（PFA）を、イモリの体が硬くなるまで、手足と尾の皮下組織に20～50μL/体重（g）/分でゆっくりと注入した。 次いで、サンプルを収集し、直ちに冷４％ＰＦＡ中に４時間置き、その後、ＥＤＴＡを使用して２日間脱塩した。

厚さ 5 μm のパラフィン包埋連続切片を HE で染色し、NanoZoomer S360 デジタル スライド スキャナー (浜松ホトニクス株式会社、浜松市、日本) を使用して 20 倍でスキャンしました。 腹部と尾部の 900 枚の連続スライドのデジタル 3D コンピューター ボリューム再構成は、Image J (FiJi バージョン 1.53f51) TrakEM2 プラグインを使用して実行されました58,59。 組織切片がプレパレーションアーチファクトによって大きく歪んだり損傷した場合、その画像はスタックから除外され、組織の体積を維持するために最もよく適合する隣接する画像が複製されました。 リンパ管は逆行的に追跡およびマークされましたが、血管はLHから順行的にマークされました（補足図iv）。

サンプルを 2.5% グルタルアルデヒド中で 4 °C で 2 時間前固定し、その後 K-CX (Falma、東京、日本) を使用して脱塩し、PBS で 10 分間 3 回洗浄し、1% OsO4 で 1 時間後固定しました。 ＰＢＳ洗浄を１５分間２回繰り返し、サンプルを漸増濃度のエタノール中で脱水し、次いでアセトンに移した。 サンプルを浸潤させてからエポキシ樹脂に埋め込みました。 トルイジンブルーで染色した連続 400 μm 走査切片を光学顕微鏡用に調製し、80 nm 切片を透過電子顕微鏡用に切り出し、JEM-1400 フラッシュ電子顕微鏡 (JEOL、東京、日本) を使用して観察しました。

分析は、SPSS 26 (IBM Corp. リリース 2019. ニューヨーク州アーモンク) および SPSS 27 (IBM Corp. リリース 2020. ニューヨーク州アーモンク) を使用して実行されました。 実行されたすべての統計検定は両側検定であり、p < 0.05 が統計的に有意であるとみなされました。

2020年1月、東京で開催された第31回東京大学形成外科学術会議で発表。

この研究の結果を裏付けるデータは、合理的な要求に応じて責任著者から入手できます。

血管内皮細胞

インドシアニングリーン

近赤外透視リンパ管造影

リンパ内皮細胞

リンパ系心臓

超短波超音波検査

横縦リンパ管幹

傍腹部縦リンパ幹

傍心窩縦リンパ幹

縦方向の椎骨下リンパ幹

横椎骨内リンパ管

横椎骨内静脈

後大静脈

外側静脈

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この研究は、日本学術振興会の科研費（助成金番号：21K09764、18H04061）の助成を受けて行われました。 提供された一般的な管理上のサポートを提供してくれた信濃キク氏、実験を支援してくれたジャクソン・チパイラ博士、白石泰三教授、飯野高原博士、波方美幸氏に心から感謝したい。

この研究は、日本学術振興会の科研費（助成金番号：21K09764、18H04061）の助成を受けて行われました。

三重大学大学院医学系研究科形成外科学教室〒514-8507 三重県津市江戸橋2-174

Chihena H. Banda, Makoto Shiraishi, Kohei Mitsui, Yoshimoto Okada, Kanako Danno, Ryohei Ishiura, Kaho Maemura & Mitsunaga Narushima

筑波大学生命環境系〒305-8571 茨城県つくば市天王台1-1-1

千葉親文

〒514-8507 三重県津市江戸橋2-174 三重大学大学院医学系研究科個別化がん免疫療法学分野

Akira Mizoguchi

〒514-8507 三重県津市江戸橋2-174 三重大学大学院医学系研究科病理学・マトリックス生物学分野

Kyoko Imanaka-Yoshida & Kazuaki Maruyama

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CHB、MS、MN、CC、Ko.M。 研究をデザインした。 CHB、MS、MN、YO、KD、RI、Kah.M. そしてCCはデータの取得を実行しました。 CHB、MS、MN、Ka.M、CC がデータの分析と解釈に参加しました。 CHB が原稿を作成し、MS、RI、MN、YO、KD、Ko.M.、Ka.M.、KIY、AM、CC が原稿を改訂しました。 リストされた著者全員が原稿の最終版を承認し、この研究の内容について個人的に責任を負うことに同意しました。

Correspondence to Mitsunaga Narushima.

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

シュプリンガー ネイチャーは、発行された地図および所属機関における管轄権の主張に関して中立を保ちます。

補足ビデオ1.

補足ビデオ2.

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転載と許可

バンダ、CH、白石正人、三井一二 他イモリのリンパ系の構造と機能の解析。 Sci Rep 13、6902 (2023)。 https://doi.org/10.1038/s41598-023-34169-w

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受信日: 2022 年 12 月 19 日

受理日: 2023 年 4 月 25 日

公開日: 2023 年 4 月 27 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-34169-w

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