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Scientific Reports volume 13、記事番号: 184 (2023) この記事を引用

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液滴マイクロ流体工学は、新しいデジタル分子アッセイ、疾患スクリーニング、創傷治癒および材料合成技術が提案されているプラ​​ットフォームを提供します。 しかし、現在の商用液滴生成、組み立て、およびイメージング技術は高価かつ厳格すぎて、液滴の特徴/積荷を迅速かつ広範囲に調整することはできません。 このラピッドプロトタイピングのボトルネックにより、そのアプリケーションのさらなる拡大が制限されています。 ここでは、安価な自家製ピペット液滴マイクロ流体キットを紹介します。 このキットには、簡単な DIY (Do-It-Yourself) ツールで製造できる楕円形のピペット チップ、独自のテープベースまたは 3D プリントされた浅い中心のイメージング チップが含まれており、スマート デバイスによる迅速な単層液滴の集合/固定化とイメージングが可能になります。携帯電話のカメラや小型顕微鏡。 液滴は、高価で研究室専用のマイクロ流体ポンプを使用せずに、手動または自動ピペッティングによって生成されます。 液滴のサイズと流体の粘度/表面張力は、当社の特定の液滴生成、組み立て、およびイメージング設計により大幅に変化する可能性があります。 このラピッド プロトタイピング キットの多用途性は、液滴マイクロ流体プラットフォームから恩恵を受けることができる 3 つの代表的なアプリケーションで実証されます: (1) 標的 RNA を検出および定量するための逆転写を伴う PCR 反応用のマイクロリアクターとしての液滴。 (2) スピルリナ培養用のマイクロコンパートメントとしての液滴、およびスピルリナによる液滴の光学的色/濁度の変化は、光合成培養の成功を確認します。 （３）金キャップポリアクリルアミド／金複合ヤヌスマイクロゲルの制御合成のためのテンプレート／型としての液滴。 したがって、製造が簡単で使いやすいポータブル キットは、設計、トレーニング、教育ラボに最適です。

液滴マイクロ流体工学は、さまざまな学際的なアプリケーションのための強力なツールとして浮上しています 1,2。 液滴マイクロ流体工学に基づいて商業化および提案されている興味深いバイオテクノロジー技術には、単一細胞アッセイ 3,4、液滴デジタル PCR5,6、迅速がんスクリーニング 7,8、薬剤または免疫療法スクリーニング 9,10、抗生物質感受性スクリーニング 11、移植可能な膵島同種移植 12,13 などが含まれます。これらおよび他の多くの用途では、液滴は通常、マイクロリアクター、マイクロコンパートメント、またはテンプレート/モールドとして使用され、それらの多くは液滴マイクロ流体工学の独特の利点を保証します14、15、16、17。 良い例は、液滴をマイクロリアクターとして使用する液滴デジタルポリメラーゼ連鎖反応 (ddPCR) です 6,18。 PCR 反応混合物を多数の均一な液滴に分割するだけで、標的核酸はポアソン分布に従って液滴に分散され、その後 PCR 増幅後にシングルコピー分解能で定量化できます 19。 パフォーマンスの向上は、多数の液滴 (104 ～ 106 個) によって強化され、阻害剤や非ターゲットの影響を軽減し、面倒な標準曲線の構築を行わずに絶対定量を可能にします 20,21。 別の例は、液滴または液滴由来ミクロゲルへの細胞/微生物のカプセル化です。これは、単離された単一細胞および微生物のハイスループット研究のための適切な生物物理学的/生化学的微小環境を備えた多数のマイクロコンパートメントを提供し、連続アッセイ分析が許可されている場合でも大規模なスクリーニングと最適化を促進します。透過性ミクロゲルによる13,22,23,24,25,26,27,28。 マイクロリアクターおよびマイクロコンパートメントの用途に加えて、マイクロテンプレート/型としての液滴が、ソフトおよびハードのマイクロ/ナノ材料の合成に提案されています 29,30,31。 制御された小型サイズ、単位体積あたりの大きな表面積、閉じ込め、および多数の液滴により、高い疎水性勾配、強力な界面活性剤/表面相互作用およびクラウディングによってもたらされる急速な分離および濃縮効果により、目的の構造および機能を備えた材料の容易な合成が可能になります。効果32、33。 液滴マイクロ流体工学は、明らかに、数多くの分野でいくつかの有望な技術に影響を与えています。

しかし、現在の液滴生成システム 1、14、34 は、多くの場合、高度なチップ/デバイスおよび/または高精度の圧力源 (PreciGenome、Elveflow、Fluigent などの市販の液滴生成キットの価格が 5,000 ドル以上かかる) を必要とし、十分に単純ではありません。 、安価で入手しやすいため、プロトタイピングやトレーニングが容易になり、学際的な分野での液滴マイクロ流体技術の広範な実装や、商品化可能な製品への新技術のさらなる開発が制限されます。 たとえば、広く使用されているフローフォーカシング液滴生成技術には、マイクロ流体チップ内の二相流を正確に制御して微調整する必要があり 35、比較的流量に依存しないステップエマルション液滴生成には、通常、テラスを備えた慎重に設計されたチップ/デバイスが必要です 36。 均一な液滴生成に加えて、既存の閉じ込めベースの液滴集合体および顕微鏡ベースのイメージング方法も、よりアクセスしやすくカスタマイズ可能となるように簡素化する必要があります6,37,38。 したがって、調整可能なマイクロ流体液滴生成技術に加え、液滴サイズや粘弾性特性に影響されない堅牢な液滴アセンブリおよびイメージング モジュールを含む、シンプルでラピッド プロトタイピング ツール キットにより、学際的な分野でのアプリケーションのさらなる拡張が可能になります。印刷はバイオチップやマイクロ流体工学の他の分野で行われています39。 この目的を達成するために、以前に開発されたピペット液滴技術40に基づいて、標準化された包括的なピペット液滴マイクロ流体ラピッドプロトタイピングおよびトレーニングキットがこの研究で提案されており、液滴の機能を簡単に調整できるだけでなく、組み立て、固定、画像化ができる堅牢で安価なコンポーネントも可能になります。サイズが異なり、レオロジー特性や表面特性が異なる液滴。 (図1)。

ピペット液滴マイクロ流体キット: (1) トルク ドライバー ツールによる制御可能なピペット チップの修正の概略図。結果として、平らなヘッド部分を備えた変形した市販のピペット チップが得られます。 この修正により、ピペット チップの元の円形のオリフィスが楕円形に変更され、楕円形のオリフィスのアスペクト比はドライバーからのトルクによって決まります。 (2) ユニバーサルマイクロピペッターを介して改良されたチップを使用して液滴を生成します。 適切に変形されたピペットチップオリフィスを通してフッ素化オイルに水溶液を手動で分注すると、均一な液滴が自動的にピンチオフされます。 (i、ii、iii) (i) マイクロリアクターとして液滴を使用する液滴デジタル PCR、(ii) マイクロコンパートメントとして液滴を使用するスピルリナの培養、および (iii) 鋳型として液滴を使用するマイクロゲルの制御合成に関する典型的な液滴マイクロ流体応用の例/金型。

堅牢なキットの多用途性は、最大限の調整を可能にするために簡単かつ迅速に製造できる 3 つの主要なテクノロジーによるものです。 均一な微液滴は、液滴ピンチオフを強化するための楕円形のオリフィスを備えたピペット チップから液体をピペットで取り出すことによって便利に生成されます。 楕円形のピペット チップは、市販の丸いオリフィス ピペット チップを DIY トルク ドライバー ツールで変形することによって準備され、液滴のサイズは、変形したピペット チップのオリフィスのアスペクト比を変更するだけで調整できます。 液滴は、毛細管圧力駆動の​​湿潤流に基づいた堅牢な液滴集合メカニズムによって、簡単に作成できる両面テープ チップの浅い中央に詰め込まれて固定されます。 液滴懸濁液は、円形メニスカスを備えた安定した軸対称幾何学形状に近づき、液滴を中心の同心円状の単層に閉じ込めます。 このキットによって生成される大きくて固定化された微液滴 (直径 300 ～ 500 ミクロン) により、液滴イメージングが簡素化され、液滴をスマートフォンのカメラでイメージングしたり視覚的に観察したりできます。 コストの点では、DIY ドライバーベースのチップ修正ツールは 100 ドル未満、ゲルローディング チップは 1 チップあたり 10 ドル未満、マイクロ ピペッターは 200 ～ 300 ドル、イメージング チップはガラス製です。スライドと数枚の両面テープは 4 分の 1 未満であり、イメージングは​​通常の 100 ドルのスマートフォンで行うことができます (蛍光イメージングには 1,000 ドルのトランスイルミネーターまたはハンドヘルド蛍光顕微鏡が必要です)。 液滴生成、ハンドリング、イメージング（蛍光イメージングを含む）のキット全体を 2,000 ドルで実現できます。これは、液滴生成部分だけで 5,000 ドル以上かかる市販キットと比較して、非常に費用対効果が高くなります。 さらに、マイクロ ピペッター、ピペット チップ、スライド ガラス、カプトン ポリイミド両面テープは一般的なラボ消耗品であり、トルク ドライバー、スマートフォンのカメラも一般的なツールであるため、ここで提案するピペット液滴マイクロ流体キットは非常に入手しやすいことになります。 このキットの多用途性は、液滴マイクロ流体工学の 3 つのプロトタイピング アプリケーションで実証されます。(i) 標的 RNA を検出および定量するための液滴デジタル PCR 用のマイクロリアクターとしての液滴。 (ii) スピルリナの光合成培養のための微小区画としての液滴。 (iii) 金でキャップされたポリアクリルアミド/金複合ミクロゲルの制御された合成のためのテンプレート/型としての液滴。 これらの典型的な例は、液滴マイクロ流体アプリケーションのラピッドプロトタイピングおよび検証のためのピペット液滴マイクロ流体キットの多用途性と使いやすさを示しています。

チップの修正を標準化するために、一連のトルク力 (トルク ドライバーで直接調整および設定) を使用して特定の圧力を生成し、さまざまな楕円形のオリフィスを備えたピペット チップを変形させてきました (図 2、「方法」: 「楕円ピペット チップ」)チップ製造用のカスタマイズされたツールの構築および使用方法の詳細については、「準備」セクションを参照してください)。 先端オリフィスのアスペクト比と加えられるトルク力との関係を図3aに示します。 このような検量線は、同じ条件下で調製された特定のタイプのチップに対して、望ましいオリフィス アスペクト比を備えた楕円形ピペット チップを作成するための指針を提供できます。 自家製ツールは、チップの位置を特定するためのチャネルを提供し、チャネル壁の間隔バリアは、変形するチップヘッドの長さを決定するのに役立ち、楕円チップの製造条件がより再現可能になります。 （図2a）さらに、変形長さ（図2b右に示すように変形している先端ヘッド部分の長さ）を調整することにより、先端変形の程度を調整する別の方法も可能になります（図S1）。

ヘッドを平らにしたチップを準備するための標準化されたピペットチップの修正。 (a) シンプルな先端変形ツールは、3D プリントされたケース、2 つのガラス/金属スライド、スチール クランプ、トルク ドライバーで簡単に組み立てられます。 使用するときは、ピペット チップを 2 枚のガラス/金属スライドの間または下に挿入します。 ガラス/金属スライドは、3D プリントされたケースと組み立てられると自由に回転できなくなり、トルク力が圧力に伝達され、市販のピペット チップのヘッド部分が変形します。 (b) トルクドライバーのトルクを 0 ～ 20 に設定することにより、ヘッド部分の変形度合いを変化させた改造ピペットチップ (変形長さ: ～ 3.5 mm) を準備します。

一定の変形長さ (~ 3.5 mm) でトルク力を変更することによるピペット チップの変更の制御と、対応するピペット液滴生成: (a) ピペット チップの断面アスペクト比とチップ変形に適用されたトルク、チップの変形長さは ~ 3.5 mm、挿入画像は典型的な変形したチップオリフィスの断面図です。 (b) トルク変形ピペット チップで生成された水滴の平均半径。各点は、対応する変形チップによって生成された液滴の平均半径と標準偏差 (エラーバー) を表します。挿入された画像は、オリフィス断面を持つチップによって生成された液滴です。 (a)に挿入された画像。 曲線に基づいて、対応するトルク力を適用することにより、特定のチップと液滴を準備できます。

異なる変形長さおよび/または異なるトルク力を有する変形した先端は、先端オリフィスをチェックすることによって特徴付けられます (図 2b、3a、S1a、b、S2a、b)。 同じトルク力の下で、圧力を共有するチップヘッドが短ければ短いほど、チップヘッドの変形は大きくなります（図S1b）。 同様に、同じ変形長さの下で、加えられるトルク力が大きくなるほど、先端ヘッドの変形は大きくなります（図 3a、S2b）。 さらに、機械的特性が異なるチップ（チップの材質、オリフィス寸法、壁の厚さなどが異なるため）は、同じトルク力によって引き起こされる圧力下で異なる動作と変形を行います（図S3a）。 この結果、新しいタイプのチップについては、対応する新しい検量線を標準プロトコルを通じて取得する必要があります。

変形ピペットチップには、液滴生成用の通常の 20 µL ピペッターが装備されています。 技術的には、非常に低い流量の滴下モードで均一な液滴が生成されます14。 しかし、変形した楕円形のピペットチップでは、ネックの水圧の上昇によりピンチネックから水が排出されるため、高流量でも液滴の自動的なピンチオフが発生します。 この圧力の上昇は、楕円形の断面の狭い端部の方位角の曲率が増幅されることによるものです。 ネック毛細管圧力の強化により、高アスペクト比チャネルを備えたマイクロ流体チップからのステップエマルジョン液滴生成と同様の、より強力かつ高速で小さな均一な液滴が生成され41、液滴の生成は中程度の流量変化の影響を受けないため、手動ピペッティングで均一な液滴を生成することが容易になります。水滴。 (ビデオ S1) 図 (図 3b、4、S1c、S2c、S3b、S4) に示されているように、ピペット チップのオリフィスのアスペクト比が高くなるほど、生成される液滴は小さくなり、より均一になります。 アスペクト比が約 3.25 になると、生成される液滴の変動係数 (CV) は 5% 未満になり、アスペクト比が約 4 になると、生成される液滴の CV は 2% 未満になります。 液滴の均一性は、液滴 CV が 3% 未満であると主張する Elveflow 液滴生成パックなどの市販の液滴生成システムに匹敵します42。 オリフィスのアスペクト比が低いチップで生成される液滴の不均一性が大きいのは、2 つの理由によるものです。 第一に、対応する生成されたままの液滴はより大きく、より大きな液滴は、液滴の生成および取り扱い中により小さな付随液滴に容易に分解される。 第 2 に、先端が楕円形ではない液滴生成では必要な流量が低くなり、ピペッティング中の外乱の影響を受けやすくなります。 図 4 の液滴範囲は、異なるオリフィス サイズのピペット チップを使用することでさらに拡張できます (図 S5)。

さまざまなチップオリフィスのアスペクト比を持つ一連の変形ピペットチップ (この作業ではデフォルトで 200 μL チップが使用されています) によって生成された水滴。 一般に、特定のタイプのチップでは、チップ オリフィスのアスペクト比が高いほど、生成される液滴はより均一になります。

均一な液滴が生成されると、プロトタイピングのもう 1 つの課題は、液滴の組み立てとイメージングです。 軽い水滴は分散した油相の上部に浮く傾向があり、自発的に集合して観察用の単層を形成することはありません。 さらに、湿潤オイルは液滴を画像形成位置から運び去ってしまうことがよくあります。 これらの問題は通常、液滴を単層に閉じ込めて詰め込むピラーやその他のバリアを備えた複雑な密閉型チップ設計によって解決されます6、37、38。 このような障壁に対して液滴を所定の位置に固定するには、持続的な背圧が必要であり、負荷はマイクロ流体の主要な作業になります。 また、固体バリアとの接触は液滴の合体を引き起こすことが多いため、異なるサイズや粘弾性の液滴に合わせて調整する必要がある正確な充填流量が必要になります。

当社のアセンブリチップの中心が浅い設計により、チップの中心での自発的なアセンブリが可能になるため、ピペットによる手動ローディングが可能になります（図5およびビデオS2）。 たとえそれらが中心の高さよりも小さいとしても、湿潤油の流れに対する傾斜チャネルの高さの影響により、液滴集合体も中心に固定される。 したがって、液滴は壁に接触することはありません (図 5b、c およびビデオ S2)。 接触線の抵抗を最小限に抑えるために、液滴/油懸濁液を充填した後、湿潤接触線は不規則な形状から浅い中心の周りで軸対称の形状に変化します。 この接触線の広がりは、基材上に広がる湿潤油によって引き起こされます。 しかし、懸濁液の液滴が中心に固定されるのは、懸濁液の周囲にある凹面メニスカスの毛細管圧によるものです。 湿潤オイルは基板上に薄膜を形成し、周囲の空気圧に対して負のメニスカス油圧を維持する凹面メニスカスを生成します43、44。 毛細管圧力の大きさは、メニスカスでのチャネルの高さに反比例します。 サスペンションが半径方向外側に突出すると、その位置でのチャネルの高さが大きくなるため、突出部の先端でより大きな曲率半径を有するメニスカスが生じることになる。 このより大きなメニスカス半径により、負のメニスカス油圧が減少し、液体を突起から排出して突起の成長を阻止します。 したがって、中心の放射状に軸対称の形状はオイルサスペンションによって近づき、浅い中心に固定されます。 軸対称に向けたこの調整中の放射状の流れは、液滴を浅い中心に向かってパックして固定し、メニスカスの周囲から離れた円形の単層を形成します。 移動接触線での高いせん断速度によるせん断誘起移動と、そこにある基板による疎水性反発の強化により、液滴は懸濁液の周囲のメニスカスから離れて中心に向かって移動します43。 したがって、液滴が中心のギャップ高さよりも小さい場合でも、組み立てられた液滴単層の円も、円形の接触線 (メニスカス) と同心の浅い中心に固定されます。 ピン留めされた接触線と液滴単層は、チップを繰り返し傾けても安定したままであるため、イメージング施設への輸送が可能になります。 6 層テープ フレームのチャンバー高さは、ピペットで生成された液滴の単一単層を組み立てて固定するように選択され、液滴のイメージングと分析が簡素化されます。 チップの寸法は、さまざまなサイズと量の液滴に対応するために変更できます。 中心が浅いチャンバーを備えたチップがオイルで濡れている限り、液滴はチップ チャンバーの浅い中心に固定され、イメージングと液滴の取り扱いが簡素化されます。 さらに、カバーフィルムを持ち上げることなく、ピペットチップをチップチャンバーの中心に挿入して液滴をロードできるように、テープフレームの隅にノッチを切り込むこともできます（図S6）。 チップからの液滴のアンロードという点では、液滴のローディング (ビデオ S3) の逆のプロセスにすぎません。

スライドガラス上の両面テープで作られた液滴集合体とイメージングチップ：（a）液滴がどのようにロードされるかを示す、隅にチップを備えたチップのスキーム。 （ｂ）カバーフィルムを持ち上げることにより、チップの隅から液滴を充填する。 （c）その後の取り扱いとイメージングのために、チップの浅い中央に固定化された装填された単層液滴。

中心が浅いチップは、油で濡れる透明な樹脂を使用して 3D プリンティングによって製造することもできます (図 6)。 このチップは、壁から中心に向かって傾斜した高さを有するように設計されており、テープベースのチップの場合と同様に、チャネルの高さは約 600 ミクロンです。 予想どおり、集合した液滴は、取り扱い中および画像化中に中心に固定されたままになります（図6c）。 この樹脂 3D プリント チップの問題の 1 つは、おそらく開始剤の残留物が原因で、チップが緑色の蛍光をブロックすることです。 この問題は、射出成形を適用して溶融ポリマーからチップを製造すれば解決できます。

3D プリントされた液滴アセンブリと、適合するプラグを備えたイメージング チップ: (a) チップの 3D モデルと浅い中心設計を示す断面図。 (b) プリントされたチップ。 (c) 後の取り扱いとイメージングのためにチップ内に固定化された単層液滴。 内部チャンバーの高さが中心に向かって傾斜しているため、液滴はチップ内部の壁から離れたままになります。 液滴イメージングチップの外形寸法は20mm×20mm×2.5mmです。

十分な数のナノリットルの微小液滴があれば、単一核酸の ddPCR 検出と定量が可能になります。 一般的な例として、ヒト GAPDH PCR 試薬は、ヒト RNA の検出と定量に使用されます。 ここでは、逆転写も行われるように、DNAではなくRNAがターゲットとして選択されています。 ヒト GAPDH PCR 試薬キットは、バルクリアルタイム定量ポリメラーゼ連鎖反応検査における他のサンプル核酸の正規化のための基本的な内因性コントロールとして、生物工学/生物学研究室で広く適用されています 45,46。 したがって、安価な GAPDH PCR 試薬キットとヒト コントロール RNA はトレーニング目的に最適です。 PCR 反応ミックスを含む液滴は、通常の PCR チューブ内の高密度のフッ素化オイルの上部に凝集し、熱サイクル中に合体する傾向があります。 この問題は、約 1 w/v% の F127 を共界面活性剤として水相に添加することで解決できます。

ddPCR 後の液滴の蛍光イメージングについては、このキットでは 2 つのアプローチが提案されています。 1 つ目は、一般的なスマートフォンのカメラと、電気泳動ゲルを観察するために研究室で頻繁に使用されるトランスイルミネーターを利用することです。 ピペッティングによって生成される液滴のサイズは通常数百ミクロンであるため、視覚的に観察したり、スマートフォンのカメラで画像化したりできるほど十分な大きさです。 青色光照明とトランスイルミネーターからの琥珀フィルターフィルタリングを使用して、液滴の緑色蛍光（FAM色素）を記録できます（図7b）。 スマートフォンとトランスイルミネーターの組み合わせが現実的でない場合、2 番目のアプローチは、安価な手持ち式蛍光ミニ顕微鏡を使用することです (図 7d)。 どちらの方法も PCR 反応後にテストされており、どちらの場合でも陽性液滴 (増幅された強い緑色蛍光によって示される標的を含む液滴) が明確に観察できます (図 7)。 手持ち小型顕微鏡で撮影した液滴蛍光画像（図7d）は、スマートフォンのカメラで撮影した画像（図7b）よりもコントラストが優れていますが、識別できる陽性液滴の数は2つのアプローチの画像で同じです。 したがって、ddPCR 反応後の液滴蛍光のイメージングには、信頼性が高く利用しやすいソリューションが利用可能です。

40 熱サイクル後の、(a) または (b) 蛍光照明/フィルタリングなしまたは (b) 蛍光照明/フィルタリングなしのスマートフォンとトランスイルミネーターによる、および (c) または (d) 蛍光照明/フィルタリングなしのハンドヘルドミニ顕微鏡による ddPCR 液滴のイメージング。 液滴は、20 インチポンドのトルク力によって変形したピペット チップを介して生成されます。 どちらの方法も、液滴を適切に画像化するのに十分です。

効果的な液滴蛍光イメージングにより、標的核酸の定量が可能になります。 トレーニングやプロトタイピングの目的では、液滴の総数を把握したり、ポアソン統計を使用したりせずに、陽性の液滴を数えることによって定量化を行うのが最適です。 コピー数が低く、液滴の数がターゲットの数を大幅に上回っている場合、陽性の液滴の総数はターゲットの総数とほぼ等しくなります。 液滴を確実に定量化するには、液滴の生成およびイメージング中にサンプルの損失が無視できる程度である必要があります。 ピペットで移されたナノリットルの液滴は、低ターゲット濃度サンプルの計数ベースの定量化のすべての要件を満たしています。 いくつかの低標的濃度 (20 µL 反応混合物中 0 ～ 1 ピコグラム) サンプルに対して繰り返し実験が行われ、陽性液滴計数に基づく定量結果が表 1 および図 8 に示されています。線形関係は、この方法が適切であることを示しています。低ターゲット濃度サンプルの大まかな定量と正確な検出には十分です (図 8)。 対象濃度が増加するにつれて標準偏差は増加しますが、変動係数はすぐに 20 ～ 30% の範囲で安定します (表 1)。この変動は、おそらく低濃度のサンプル溶液中の対象濃度の変動、サンプルの体積変動によって引き起こされると考えられます。マイクロピペッター、および PCR チューブおよびピペットチップ表面に対する標的分子の親和性。 さらに、表 1 の平均偽陽性、ブランクサンプルの標準偏差、および最低非陰性濃度サンプルの標準偏差に基づいて計算された検出限界 47 (LoD = 0.2 + 1.645*0.45 + 1.645*1.82 = 3.92) は 3.92 です。これは市販の ddPCR 製品と同等であり、計数ベースの定量化は 20 ～ 30% のばらつきがあるため大まかな推定に近いにもかかわらず、ピペット ddPCR が正確な検出に適していることを示しています。 (表 1) この実証ではヒト RNA が使用されていますが、この技術はウイルス RNA を定量化し、異種検体における SARS-CoV-2 ウイルスの PCR 検査の偽陰性検出率を下げるために応用できる可能性があります 48,49。 したがって、このキットは、核酸の検出と定量のための液滴デジタル PCR の優れたトレーニングを提供します。

陽性液滴計数に基づく低ターゲット濃度サンプルの定量化。 エラーバーは標準偏差です。

微小液滴は、細胞や微生物が生息するための隔離された微小区画と微小環境を提供し、この機能は単一細胞/微生物の分析/スクリーニング 22,23,24,25 や新興の液滴/細胞工場 50,51 に積極的に使用されています。 これらの用途の多くにおいて、液滴は単一細胞または微生物の不可欠な操作およびアッセイを提供します。 例として、私たちが提案したキットによる液滴のカプセル化を示すために、単一微生物のスピルリナをテープベースのイメージングチップ（図9）またはPCRチューブ（図S7）内の大小の微小液滴中で培養します。 スピルリナは、優れた光合成効率を持ち、動物や人間にとってさまざまな栄養素や成分を生成する食用藍藻の一種です。 フッ素化オイル中の高い O2/CO2 溶解度 (水の 10 ～ 20 倍) が微生物の増殖を維持するため、スピルリナの光合成増殖は活発です 52,53。 時間の経過とともに、スピルリナの数が増加し、最終的には液滴全体を占めるようになります (図 9、S7)。 10 日間の培養後、6 回の実験から計算された増殖率 (少なくとも 4 コピーのスピルリナを含む液滴の数 / スピルリナを含む液滴の総数) は 96.9 ± 1.8% です。 より小さな微小液滴内でのスピルリナの成長は、おそらくスペースと栄養素の供給がより限られているため、比較的遅くなります。 （図9a〜d、i、j）液滴の閉じ込めは効果的であり、スピルリナが他の液滴に拡散したり移動したりすることは観察されません（図9c、g、j、l）。 さらに、液滴の閉じ込めにより、生体適合性界面活性剤で形成された美徳/柔らかい壁（液滴/油界面）によってスピルリナが隔離され、保護されます54。 液滴は数日間の光合成成長後に水の蒸発により縮小する可能性がありますが、ピペットで生成された大きな微小液滴は依然としてスマートフォンイメージングに十分な大きさであり、継続的な成長はスピルリナ微生物が10日以上生きていることを意味します（図9e–h、S7）。 陽性液滴中の増殖したスピルリナによって引き起こされる色または濁度の違いは、培養が成功したことを確認し、細菌液滴デジタル定量化について報告されているものなど、適切な培養後の低濃度微生物サンプルのデジタル定量化を意味します55。

テープベースのイメージングチップ内の小さな（a〜d）および大きな（e〜h）微小液滴におけるスピルリナの光合成培養：（a、e）生成された液滴中のスピルリナ。 (b、f) 5 日間の培養後の陽性液滴中の増殖したスピルリナ。 （c、g）10日間の培養後の陽性液滴中の増殖したスピルリナ。 （ d 、 h ）10日間培養した液滴のスマートフォンイメージング。特に大きな微小液滴において、スピルリナと陽性液滴の認識可能な色/濁度の違いを示しています。 (i – l) それぞれ (a、c、e、g) に対応する低倍率画像。

直感的には、液滴はミクロゲル合成の優れたテンプレート/鋳型です。 架橋の開始により、アクリルアミド重合前駆体を含む液滴は均一なミクロゲルに変わります（図 10a ～ d）。 液滴における液体からゲルへの変換は、金キャップを備えたポリアクリルアミド/金複合ミクロゲルを合成するためにさらに利用されます（図10e-h）。 このアイデアは、ゲル化/沈殿反応のさまざまな速度論的時間スケールとその生成物のさまざまな物理的特性を利用して、合成された材料をパターン化することです。 一般に、ゲルネットワークは内部合成反応に閉じ込め効果をもたらし、沈殿物の沈降を防ぐだけでなく、表面吸着/反応を導入して、異なる構造/形態を持つ材料を生成します。 例えば、バルク液体およびゲルネットワーク内の異なる結晶構造を利用して、異物をプログラム可能に組み込むことによってパターン化された単結晶を合成している56。 ここでは、アクリルアミドゲル化前駆体を 100 mM クエン酸ナトリウムおよび 50 mM 塩化金 (III) と混合します。この溶液は、顕著な金の減少が起こるまで約 6 分間安定します。 6 分間の時間は、通常、完了までに約 3 分かかる 20 μL 混合液のピペットによる液滴生成に十分です。 生成されたままの液相液滴における金の還元は速く、液滴生成後約10分でかなりの量の還元された金が各液滴の底に沈殿します（図10e、f）。 2分間のUV曝露により、液滴は重合して架橋してミクロゲルになり、同時に底部半球で以前に沈殿した金を捕捉してミクロゲル上に金キャップを形成します（図10g、h）。 イメージングのための後続の操作によって引き起こされる撹乱（回転と動き）の後、金キャップはランダムな方向を向いています（図10h）。これはミクロゲルの形成を示しています。そうしないと、架橋前液体と同様に金ギャップがすべて底に沈殿します。液滴（図10f）。 さらに、おそらく、その場でのポリアクリルアミドネットワーク形成による閉じ込めと金の還元効果のせいで57、古典的なワインレッドの色で示されるように、新しく還元された金は、ゲル化するとすぐにミクロゲルのゲルネットワークナノ細孔内の金ナノ粒子に融合します。ミクロゲル（図１０ｇ）。 キャップ付きポリアクリルアミド/金複合ミクロゲルの制御合成のこの例は、液滴が、所望の構造および組成を有する機能的パターン化ミクロゲルまたは粒子の合成のための有望な鋳型およびテンプレートであることを示している 33,58。

マイクロゲルの制御合成：（a〜d）異なるピペットチップを使用して20μLの混合物から調製した2つのサイズのポリアクリルアミドミクロゲルのスマートフォン画像（a、c）および顕微鏡画像（b、d）。 (e、f) ゲル化前のゲル化前駆体と金還元源を含む液滴。 液相液滴では、還元された金は密度が高いため、液滴の底に沈殿します。 液滴は UV 架橋され、(g、h) でキャップされたポリアクリルアミド/金複合ミクロゲルが合成されます。 UV ゲル化プロセスは金の還元も促進し、その場で形成されたポリアクリルアミドのネットワークが還元された金の成長を閉じ込めて、(g) 金ナノ粒子で満たされたワインレッドのミクロゲルを生成します。 各液滴の底に事前に沈殿した金は所定の位置に固定され、最終的には金キャップを備えたミクロゲルが調製されます (h)。 (a、c、e、g) の画像はスマートフォンで撮影され、(b、d、f、h) の画像は卓上顕微鏡で撮影されています。

要約すると、この研究は、初心者やさまざまな背景を持つ非専門家の研究者が使用できる液滴マイクロ流体工学用の自家製ラピッドプロトタイピングキットを提供しました。 液滴生成/アセンブリ/イメージングという困難でトリッキーな液滴マイクロ流体ワークフローは、多くの場合、調整が困難な高価な商用機器を必要としますが、簡単に製造できる楕円形のピペットチップを使用したピペットによる液滴生成、液滴のアセンブリ、および中心の浅いチップでの固定化によって簡素化されます(テープまたは 3D プリントで作製）、スマートフォンまたは携帯用ミニ顕微鏡による液滴イメージング。 これらの設計により、さまざまなサイズの、任意の粘度、表面張力、細胞含有量の分散流体を含む均一な液滴を簡単に生成できます。 単一分子、単一微生物、および液滴をそれぞれマイクロリアクター、マイクロコンパートメント、およびテンプレート/モールドとして使用する材料合成におけるこの液滴マイクロ流体プラットフォームの多用途用途を実証するために、3 つの例が選択および実行されます。 (i) 定量化するための液滴内での液滴デジタル PCR 反応高価な機器を購入することなく、必要なときに低コピー RNA を入手できます。 (ii) 液滴中でのスピルリナ光合成培養。 (iii) キャップされたポリアクリルアミド/金複合ミクロゲルの制御された合成。 3 つの例については詳しく説明していませんが、このキットを使用して広範なラピッド プロトタイピングとテストをサポートできることを実証しました。 したがって、ピペット液滴キットは、専門家以外のユーザーによる液滴マイクロ流体技術の設計、プロトタイピング、および人材トレーニングを容易にする必要があります。

先端修正プロセスを標準化するために、トルク ドライバー ベースのツールが組み立てられます。 基本的に、ツールはトルク力を圧力に変換してピペットチップを変形させます。 金属クランプは 3D プリントされたケースと組み合わされており、ガラス/金属スライドの回転や変形中のピペットチップの動きを防ぎます。 3D プリントされたケースのモデル ファイルはサポート情報で提供されます。

楕円形のピペットチップを準備するには、通常の丸いオリフィスチップ (Fisherbrand™ ゲルローディングチップ、1 ～ 200μL、特に指定がない限り、この作業ではデフォルトのチップが使用されます) のヘッド部分を 2 枚のガラスの間または下に挿入します。 /金属スライドは先端修正ツールに取り付けられています。 3D プリントされたケースのチャネルはチップの位置を特定するのに役立ち、チャネル壁の間隔バリアは、チップがより制御可能で再現可能な方法で変形されるように、変形のためにチップを挿入する時間を決定するのに役立ちます。 特定のトルク力がトルク ドライバーに直接設定され、ドライバーを使用して、希望のトルクに達するまで金属クランプ上のネジを駆動します。 10 秒後、トルクを解放し、変形したチップを取り外します。 ドライバーがチップを圧縮している間、ガラス/金属のスライドは 3D プリントされたケース内で自由に回転できないため、トルクが圧力に変換され、ピペット チップのヘッド部分が目的の楕円形の断面に変形します。 トルク力が 20 インチ ポンドを超えると、剛性のガラス スライドが破損します。より高い変形トルク力の下でチップを変形させるために、より強力な金属またはその他の材料のスライド/プレートを使用できます。

チップオリフィスのアスペクト比を測定するには、購入したままのチップまたは変形したチップからオリフィスから約 2 mm の長さの断片を新しいカミソリの刃で切り取り、その切断片を両面ポリイミド カプトン テープに垂直に接着します。通常のスライドガラスに貼り付けます。 イメージングを容易にするために、元のチップのオリフィスの表面がテープの表面に接触しています。 その後、スライドガラス上の先端オリフィスが顕微鏡（Olympus IX71）で画像化され、オリフィスの2つの軸（長軸と短軸）がAdobe Illustratorの2つの直交する配位線分によって測定されます（図S8）。 簡単に言うと、先端開口部の画像の場合、長軸を示す線が引かれ、その線が所定の位置にコピーされて 90 度回転されます。 コピーして回転した線は、オリフィスの短軸の長さに合わせて調整されます（長さのみが変更され、線の回転やオフセットは行われず、長軸と短軸の線が互いに直角になり、中点で交差します）長軸の）。 最後に、2 本の線の長さが記録され、アスペクト比、つまり (長軸の長さ)/(短軸の長さ) を計算するために使用されます。

ヘッドが平らになったピペット チップは、通常の 20 µL マイクロ ピペッターに取り付けられます。 その後、約 10 µL のフッ素化オイル (2 wt% RAN-008 界面活性剤を含む HFE 7500、RAN Biotechnologies) をピペット チップに吸引し、続いてピペットでチップから 200 µL PCR チューブ (Cole-Parmer、商品番号 EW) に移します。 -67103-90) 40 ～ 50 µL のフッ素化オイルがプレロードされています。 ピペットチップを約 50 秒間空気乾燥させます。 次に、先端が変形したマイクロピペッターを使用してサンプル液体を吸引します。 サンプル液体の入ったピペット チップを、200 µL PCR チューブ内のあらかじめロードされた 40 ～ 50 µL のフッ素化オイルに挿入します。 数秒後、オイルはチップのオリフィス表面の内側と周囲を濡らします。 場合によっては (粘性のあるサンプル液体、高度に変形したチップなど)、オイルがチップヘッド内であまり濡れないため、マイクロピペッターを後方に調整して体積を 0.5 ～ 1 µL 増やすと、オイルをチップヘッドに送り込むのに役立ちます。チップ内面を濡らします。 チップヘッドをオイルで濡らした後、チップ内のサンプル液体がピペットでオイルの中にゆっくりと取り出され、自動的にピンチオフされて均一な液滴になります。 推奨されるピペッティング流量は 10 µL/min 未満です。 液滴生成は小さな流量変化に影響されないため、高アスペクト比の楕円チップの場合は手動ピペッティングで液滴生成が可能です。 ただし、自動ピペッティング液滴生成には、流量が制御された電動マイクロピペッターをお勧めします。

当社独自の浅中心チップは、スライドガラス上に一般的なポリイミド両面テープを6層重ね、液滴用の積層テープからチャンバーを切り出し、その上部をテープ保護フィルム（テープライナー）で覆ったものです。ロード中。 テープ保護フィルムを置くとき（最初にテープに接触していたフィルム面を下にして、後でテープフレームに貼り付けます）、テープフレームの中央にある透明なフィルムを親指で簡単にスライドガラスの表面に押し付け、クリアフィルムの裾部分がテープフレームにしっかりと密着します。 カバーリング中は中央の透明フィルムが押さえられているため、圧力を解除するとフィルムは少しはね返りますが、テープチップの中央ではフィルムとスライドガラスの隙間が狭くなります（図S9）。 フィルムの中心をスライドガラス面に、スカートをテープフレームに強く押し付けて、中心の隙間をできるだけ狭くすること、特に粘着テープのフレームがない場合は、コーナーを持ち上げた後でも中心が浅くなるようにすることをお勧めします。サンプルロード中にアップします。 浅い中心があれば、狭いギャップの高さを非常に正確に制御する必要はありません。 サンプルをロードする前に、純粋な油相を使用してチップをテストし、浅い中心が中心ウェル内の油を安定させることができることを確認できます。 油相がテープフレームの壁に浮いた場合は、油を除去してフィルムの被覆/貼り付けの手順をやり直すか、テープフレームの粘着力がなくなった場合は新しいチップを作成します。 チップの寸法は非常に柔軟であり、75 mm x 50 mm のガラス スライド、外側 50 mm x 50 mm、内側 30 mm x 30 mm のテープ フレーム、および 56 mm x 56 mm のカバー フィルムを備えたチップが最初の使用に推奨されます。試験（図5a）。 前述したように、6 層テープベースのチップの中心のギャップ高さは約 600 ミクロンであり、この作業で液滴の充填に使用した 0.57 mm OD チップなどの特定のピペット チップの外径 (OD) から大まかに見積もることができます。 。 液滴が小さい場合は、使用するテープの層を減らしてチャンバーの中央の高さを低くする調整が必要になる場合があります。 チップは、テープフレームの接着力が弱くなり、浅い中央チャンバー構造を維持できなくなるまで再利用可能です。 より耐久性のあるチップを使用するには超粘着両面テープをお勧めします。 6 層のポリイミド テープからチャンバーを切り出すことが問題になる場合は、代わりに 2 層の高価な PCR フレーム シール チャンバー (Bio-Rad、15 × 15 mm、65 µL #SLF0601) を使用してイメージング チップを作成できます。

浅中心アセンブリチップは、上記の粘着テープ法による作製の代わりに、3Dプリントすることもできます。 このチップは無料のオンライン ソフトウェア (Tinkercad) で設計され、安価で人気のある樹脂 3D プリンター (ELEGOO Mars 2 Pro) を使用して透明樹脂 (Siraya Tech Blu 3D Printer Resident Clear V2) で印刷されます。 3D モデルは、フリー ソフトウェア (CHITUBOX Basic) で、露光時間 4 秒、ボトム露光時間 40 秒、リフト距離 8 mm、印刷層高さ 50 μm、リフト速度 80 mm/min、およびリトラクト速度 210 mm/min でスライスされます。 。 印刷後、チップはイソプロピルアルコール (IPA) 中の 25 ～ 50% 樹脂溶液で洗浄されます。 純粋な IPA 洗浄は、不完全に架橋されたチップを過剰に洗浄し、チップの表面が荒れて透明度が低下するため、推奨されません。 クリーンなチップは、使用前に硬化ボックス (ELEGOO Mercury Plus 2 in 1 洗浄および硬化ステーション V2.0) 内で 5 分間の露光で 4 回 UV 硬化されます。

購入したままの丸いオリフィス ピペット チップ (VWR® ゲルローディング ピペット チップ、1 ～ 200 µL、丸いチップ、外径 0.57 mm) を使用して、容器から液滴/油懸濁液を吸引します。 次にピペットは、粘着フィルム チップの角のカバー フィルムをわずかに持ち上げることにより、その角を通ってイメージング チップの中心に懸濁液を送ります (サポート情報のビデオを参照)。 あるいは、カバーフィルムを持ち上げずに、テープフレームの角に切り欠きを切り込み、その切り欠きを通して撮像チップの中心までチップを挿入することもできる。 同じ目的で、3D プリント チップ用にピペット入口が製造されます。 重要なのは、中心が浅い構造（高さが低い）のため、オイルが湿っていてもサスペンションは自由に流れないということです。 代わりに、スマートフォン (OnePlus 7 Pro) や顕微鏡 (Olympus IX71) による便利な光学イメージングのために、イメージング チップの中心に固定されます。 顕微鏡画像は、ピペットの液滴生成性能を検証するための液滴サイズと均一性の分析に使用されます。 簡単に説明すると、顕微鏡のスケール バーに従って ImageJ でスケールを設定し、個々の液滴の投影面積を測定して各液滴の半径を計算します。 イメージング チップ チャンバーの高さは約 600 µm であるため、それより大きい液滴はイメージング チップ内にロードされて組み立てられるときに少し平らになり、通常よりも投影面積が増加し、その後半径が増加する可能性があります。

蛍光イメージングの場合、液滴を含むチップを青色光トランスイルミネーター (Clare Chemical Research) 上に置き、次に琥珀色のフィルターをイメージング チップの上に置きます。 トランスイルミネーターをオンにした後、薄暗い環境でスマートフォンを使用して液滴の蛍光を画像化します。 トランスイルミネーターが利用できない場合は、液滴イメージングに手頃な価格のハンドヘルド ミニ蛍光顕微鏡 (Dino-Lite AM4115T-GFBW) をお勧めします。

一般的な反応ミックスは、5 µL Luna Probe One-Step RT-qPCR 4X Mix (New England Biolabs、カタログ番号 M3019S)、1 µL ヒト GAPDH プライマーおよびプローブ (Thermo Fisher Scientific、カタログ # 4333764 T)、2 µL で調製されます。 w/v% F127 水溶液、ターゲットとして 0 ～ 10 µL の希釈ヒト コントロール RNA (Thermo Fisher Scientific、カタログ番号 4,307,281)、および 12 ～ 2 µL のヌクレアーゼフリー水で混合総量を 20 µL にします。 凍結試薬は使用前に氷上で溶かし、ピペッティングで混合し、使用後はすぐに冷蔵庫に戻します。 10 w/v% F127 水溶液は、0.1 g の F127 粉末 (Sigma-Aldrich、BioReagent、カタログ番号 P2443-250G) を 1 mL の冷ヌクレアーゼフリー水 (Thermo Fisher Scientific、カタログ番号 R0582) に溶解することによって調製します。溶液は 4 °C で保存されます。 反応混合物が完了すると、前述したように PCR チューブ内に均一な液滴が生成されます。 反応混合液滴を含む PCR チューブを直ちにポータブル サーマル サイクラー (Bio-Rad、MJ Mini Thermal Cycler) に置き、52 °C で 10 分間逆転写、95 °C で 2 分間変性、40 分間のプロトコールで PCR 反応を行います。 95 °C で 10 秒、60 °C で 30 秒のサイクル。

スピルリナ (ACAp-01003) および対応する完全培地キット (塩 + 栄養素、MKAp-00001) は Algae Research Supply から提供されています。 培地は、供給者が推奨する一定量の水に塩と栄養素を溶解することによって調製されます。 次いで、スピルリナ懸濁液を培養培地で所望の濃度に希釈する。 よく混合されたスピルリナと培養培地は、20 インチポンドのトルク力で変形した楕円形の先端でピペッティングして液滴を生成することによって液滴に分散されます。 微生物をカプセル化した後、液滴（両面テープベースのイメージングチップまたは 200 µL PCR チューブに液滴生成オイルと一緒に充填）を日光の当たる窓辺に置き、スピルリナの成長と増殖を促します。 スピルリナ液滴培養中のガス交換のため、イメージングチップの角とPCRチューブのキャップを1日1回約1分間開けます。 このような条件下では、スピルリナのライフサイクルは 2 ～ 3 週間です。

ポリアクリルアミドミクロゲルの調製では、5 μL のモノマーおよび架橋剤溶液 (アクリルアミド: ビス-アクリルアミド 29:1、40% 溶液、Fisher BioReagents、BP1408-1) を 13 μL の脱イオン水および 2 μL の 2 w/v% 開始剤溶液と混合します。 。 2 w/v% 開始剤溶液は、10 mg のフェニル-2,4,6-トリメチルベンゾイルホスフィン酸リチウム (LAP、Sigma-Aldrich、900,889-1G) 粉末を 500 μL の水に溶解して調製し、溶液を含むチューブをアルミニウムで包みます。使用しないときはホイルに包み、暗所に保管してください。 得られた 20 µL の前駆体混合物は、20 インチ ポンドのトルク力で変形した楕円形の先端でピペッティングすることによって液滴に生成されます。 このピペット チップの他に、オリフィス サイズが小さい別のタイプのチップ (エッペンドルフ マイクロローダー チップ) も同じ力によって変形し、より小さいサイズの液滴を生成するために使用されます。 生成された液滴は、UV ボックス (Electro-Lite、Electro-Cure 500) で 2 分間照射した後、均一なミクロゲルに変換されます。

金キャップを備えたポリアクリルアミド/金複合ミクロゲルの制御合成の場合、溶液は 10 µL の水、5 µL のモノマーおよび架橋剤溶液 (アクリルアミド: ビス-アクリルアミド 29:1、40% 溶液、Fisher BioReagents、BP1408-1) で調製されます。 )、2 μL 2 w/v% LAP 開始剤溶液、2 μL 1 M クエン酸ナトリウム (Sigma-Aldrich、W302600-1 KG-K) 溶液、および 1 μL 1 M 塩化金 (Sigma-Aldrich、520,918-1G) 溶液。 よく混合した後、20 インチポンドのトルク力で変形させた楕円形の先端でピペッティングすることにより、溶液は直ちに液滴になります。 新しく還元された金は各液滴の底に沈殿します。 10 分後、液滴を UV ボックスに 2 分間置くことにより、液滴が架橋されてミクロゲルが形成されます。 ゲル化プロセスにより、沈殿した金が所定の位置に固定され、均一なミクロゲル上にキャップが形成されます。

著者らは、この研究の結果を裏付けるすべてのデータが論文および補足情報内で入手可能であることを宣言します。

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この研究は、戦略調整局/NIH 所長室、4UH3CA241684-03 を通じて、NIH 共通基金によって支援されています。 著者らは、ノートルダム大学のジェフリー・カンター教授が教えた機器開発コースを認めています。

ノートルダム大学化学・生体分子工学部、ノートルダム、インディアナ州、46556、米国

Liao Chen、Chenguang Zhang、Vivek Yadav、Angela Wong、Satyajyoti Senapati、Hsueh-Chia Chang

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LC は作業を開始、設計、実行しました。 H.-CC は作業をアドバイスしました。 H.-CC と SS が資金を獲得し、プロジェクトを管理しました。 CZ は 3D プリンティングの取り組みに貢献し、VY は液滴画像分析を支援しました。 AW は工学部の学生としてピペット液滴デジタル PCR のテストを支援しました。 LC と H.-CC は、著者全員の協力を得てこの論文を執筆しました。

Hsueh-Chia Chang への通信。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

シュプリンガー ネイチャーは、発行された地図および所属機関における管轄権の主張に関して中立を保ちます。

補足ビデオ1.

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補足ビデオ3.

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転載と許可

Chen、L.、Zhang、C.、Yadav、V. 他。 デジタル PCR、微生物/細胞のカプセル化、および制御されたミクロゲル合成のための自家製ピペット液滴マイクロ流体ラピッド プロトタイピングおよびトレーニング キット。 Sci Rep 13、184 (2023)。 https://doi.org/10.1038/s41598-023-27470-1

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受信日: 2022 年 5 月 26 日

受理日: 2023 年 1 月 2 日

公開日: 2023 年 1 月 5 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-27470-1

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